猪源乳酸杆菌的分离鉴定及其发酵培养条件优化
关键词猪源乳酸杆菌；分离鉴定；发酵条件；优化
中国wWw.LWlm.comIsolationandIdentificationofLactobacillusfromSwineandOptimizationofCultureConditions HAN Ya-chaoWANG Ming-yue
（Fuyang Vocational-technical College，Fuyang Anhui 236031）
AbstractProbiotics is the key to developing green pig industry. Lactobacillus is one of the most important beneficial bacterium components in the current application probiotics. One Lactobacillus strain which had strong acid and bile salts resistance was isolated，and it was identified and named Lactobacillus strain L5. The fermentation conditions in liquid culture were studied by single factor test and orthogonal test. Under optimal conditions，the living bacteria concentration reached 8.25×108 cfu/mL in the fermentation liquid.
Key wordsLactobacillus from swine；isolation and identification；fermentation condition；optimization
由于长期大量使用抗生素和化学药物的弊端日益明显，使得微生态制剂在畜牧养殖业的应用成为必然。微生态制剂进入肠道可以通过与肠道有害菌群的竞争占位、夺氧等竞争性抑制或分泌抗性物质、酶和有机酸等作用使得肠道内有益菌群成为优势种群，进而调整肠道微生态平衡，达到有利于消化、健康的作用。因此，在仔猪饲料中添加微生态制剂，可明显降低仔猪肠道疾病的发病率、提高仔猪成活率和生长率[1]。
我国是养猪大国，微生态制剂的应用是发展绿色养猪业的关键。目前微生态制剂应用较多的主要有乳酸菌类制剂、芽孢杆菌类制剂、双歧杆菌类制剂、光合细菌类制剂和真菌类制剂等。其中，乳酸杆菌（Lactobacillus）在肠道中生长繁殖，抑制有害菌生长，是动物机体内正常的生理菌群之一。乳酸杆菌能够合成共轭亚油酸（Conjugated linolEicacid，CLA），产生乙酸和乳酸，降低肠道pH值，从而提高动物的免疫力和生产性能[2]；此外，乳酸杆菌一方面可刺激肠道局部的免疫反应，另一方面通过粘附于肠道黏膜细胞上，而对肠道黏膜产生占位性保护作用。笔者从健康仔猪的肠道中分离有益的乳酸杆菌，并进行了其发酵培养基和培养条件的优化研究，为进一步研制猪用微生态制剂奠定基础。现将研究结果报告如下。
1材料与方法
1.1试验材料
供试材料：取健康的15日龄长白猪仔猪小肠黏膜。供试培养基：供试基础培养基，即乳酸杆菌选择性培养基，按照陈天寿[3]的方法进行配制；生化培养基按照赵斌等[4]的方法配制。试验试剂：试验所使用的各种试剂均按照赵斌等[4]的方法配制。 1.2.1 乳酸杆菌分离。将健康的15日龄仔猪麻醉处死，通过无菌操作刮取1 g小肠黏膜，经适当稀释后涂布在MRS琼脂平板上，于 37 ℃厌氧条件下培养48 h。挑取颜色、大小、形状、边缘、分布位置各异的单菌落，在MRS琼脂培养基上划线得到纯培养。通过革兰氏染色镜检，挑选染色结果为革兰氏阳性、不产芽孢的杆状菌株，以备后续试验用。 1.2.3乳酸杆菌耐酸性试验。菌液接种于MRS培养液中，其pH值分别为2.0、3.0、4.0、6.8（对照），并在37 ℃条件下分别处理
1、
2、3 h，通过保温前后活菌计数结果计算细菌存活率。 1.2.5乳酸杆菌生长曲线测定。将保存的菌种用MRS液体培养基活化。将活化的菌种以5%（v/v）的接种量接入MRS液体培养基，37 ℃培养48 h，其中每隔2 h取样1次测定菌液的OD值（600 nm）和pH值，用未接种的培养液作空白对照。 1.2.7发酵培养条件的优化。选择温度分别为
3
3、
3
8、43 ℃，初始pH值分别为5.0、6.0、7.0，发酵时间分别为
1
8、
2
2、26 h，设计正交试验（L934）用于优化发酵培养条件。 2结果与分析
2.1乳酸杆菌分离和菌落形态
经厌氧培养48 h后，从MRS平板上分离得到菌株62株，经染色镜检，从中筛选出无芽孢杆菌、革兰氏阳性12株，分别编号为L1~L12。其菌落特征为直径0.5~2.0 mm，菌体杆状、圆形、乳白色、表面光滑凸起、边缘整齐，多排列成长短不一的链状，也有单个分散排列。