油污土壤降解细菌的分离鉴定及其生物强化研究
摘 要：从大庆油田长期石油污染的土壤中分离出高效降解石油烃的菌株5种，通过生理生化分析和16SrDNA全序列分析，初步确定为Pseudomonas sp.（假单胞菌属）、Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌属）、Acinetobacter junii（琼氏不动杆菌属）、Microbacterium oxydans（微杆菌属）、Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌属）。在摇瓶培养和土壤固体培养条件下的石油烃降解率都远远高出了对照组。同时通过改变初始盐浓度、N源和P源，初步探测了各菌株的最适生长和降解条件，为本土微生物强化的生物修复方法提供了新的菌种资源和信息，对进一步有效实现本土微生物强化具有重要意义。
关键词：生物强化；石油污染土壤；细菌；降解率
Abstract：5 bacterial strains were isolated from the long-term petroleum-contaminated soil in the Daqing oilfield which can efficiently degrade petroleum hydrocarbons. Using physiological and biochemical assays，as well as 16S rRNA sequencing analysis，we identified these strains as Pseudomonas sp.，Pseudomonas aeruginosa，Acinetobacter junii，Microbacterium oxydans，and Pseudomonas aeruginosa.Under both liquid and solid（i.e.soil）culture conditions，these bacterial strains showed much higher petroleum hydrocarbon degrading rates than the control strain. By modulating the concentration of initial salt，N and P in the medium，we explored the optimal growth and degradation conditions of the bacterial strains. This study provides new bacterial resources and information for the autochthonous bioaugmentation of crude oil contaminated soil.
Key words：Bioaugmentation；Oil-contaminated soil；Bacteria；Degradation rate
1 材料与方法
1.1 材料
2 结果与讨论
2.1.1 各菌株的生理生化实验 经过革兰氏染色等8项生理生化鉴定实验，结果见表1。
2.1.3 耐酸碱性试验 5个菌株在pH4.0～9.0的pH区间内均可生长，在pH4.0时，仅有X3菌株表现出较好的耐酸性，其余4种菌株均在碱性条件下生长状态高于酸性条件下，并pH8.0和9.0时生长达到最大，表现出较好的耐碱性。这些菌株生长在盐碱性较高的大庆土壤，在逐步适应环境的过程中形成了较好的耐碱性，有效的对土壤中石油烃进行生物降解。
2.2 不同培养条件下细菌的降解性能
2.2.1 无机盐培养液条件下细菌的降解性能 无机盐培养基中仅有石油作为唯一碳源，能够充分体现石油降解细菌对石油的利用程度。X3和X5菌株在培养的初期就表现出较高的降解率（40%左右），并且在15d内一直保持领先，最终达到了近60%的降解率；X9降解率最低，1d时与空白相当，15d时只有X5降解率的50%左右，但也明显高于空白样品中石油烃的自然降解率。5种细菌都能够较好的利用石油烃作为碳源。
2.3 石油降解细菌原位修复的生物强化试验
2.3.2 氮源对细菌生长及石油降解率的影响 由图5，6显示，5株原油降解细菌几乎都在以NaNO3为N源时生长的最好，但相对其石油降解率却都是最低的；而在生长状况一般的以（NH4）2SO4为氮源条件下，石油降解率却都处于较高的水平。总体看来，N源对石油降解率的影响出现了反相关的趋势，这可能是代谢石油烃有关的酶等活性物质，在不同N源生长条件下活性差别较大。因此，要达到强化细菌石油降解率的条件，需选择降解率较高的NH4NO3作为N源。
2.4.2 N、P源影响细菌石油降解效率 在改变不同形式的N源和P源时发现，在生长状态好的N、P源条件下，菌株的石油降解率相对较低，而在生长状态较低的N、P源条件下，菌株的石油降解率反而相对较高。这可能是由于与细菌降解石油所需的酶等活性物质的表达受不同N、P源的调控，而这种调控与细菌细胞生长繁殖有关的基因表达调控呈现负相关，能够激活石油降解有关基因却会抑制细菌的生长。Audrew等[6]研究原油在土壤中泄漏后的生物降解能力时，发现当添加肥料的C∶N∶P=100∶5∶1.7并为缓慢释放形式时，效果最佳；其中N源主要利用NH4+，P源主要利用PO43-，与本研究的结果一致。因此，在利用微生物生物强化进行生物修复时，应当首先确定能够激活降解相关基因的N、P源种类，然后确定各物质所需的最适浓度，以保证石油降解细菌达到最佳的降解效果。
3 展望
利用微生物降解土壤中的石油污染物已经成为土壤生物修复技术的研究热点，已分离筛选出许多高效石油降解微生物，但是微生物降解石油污染物受许多复杂因素影响，如营养物质、氧气、温度、石油烃的种类等[7]。作为土壤生物修复技术的核心，为了更有效的利用已分离出的石油降解微生物，最大限度的提高降解效率，还需要从以下几个方面进行进一步的研究和探讨：
（1）已筛选出的高效石油降解微生物通常来自污染地区的本土微生物，其生长条件和对营养的需求都有较强的环境针对性，因此需要针对不同地域特点，结合地理、气候、土壤特性、污染强度、地下水埋深等影响因素，深入探讨微生物修复过程中营养物质的种类、基质投加量、混合菌剂对污染物降解的影响，建立适合本土微生物的最佳生物强化方案，最大限度的发挥其生物修复的功效。
（2）石油污染物成分复杂，包括多种烷烃和芳烃，尤其是其中的多环芳烃，种类多，结构复杂，毒性强，一直是困扰环境治理的难题。对微生物利用石油烃的机理研究是目前微生物修复工作的重中之重，研究烷烃代谢模型、影响烷烃降解酶合成的阻遏物和激活物、芳香烃代谢过程等，才能更有针对性的设计和完善微生物修复技术，使其具有更强的适用性和有效性。
（3）结合分子生物学技术，探讨微生物降解石油烃污染物的分子机理，寻找与降解代谢相关的酶基因。Beilen[8-9]发现Pseudomonas putida GPO1编码降解烷烃酶的操纵子主要位于OCT质粒，Marin[10]报道Burkholderia cepacia中控制烷烃降解的alkB操纵子比P.putida GPO1中的操纵子更容易被代谢产物中的阻遏物负调控。掌握石油烃降解酶的种类、活性、序列、调控机理，有助于开发和构建高效的石油烃降解工程菌，达到快速高效的修复效果。
参考文献
[2]K Das，AK Mukherjee.Crude Petroleum-oil Biodegradation Efficiency of Bacillus Subtilis and Pseudomonas aeruginosa strains Isolated from a Petroleum-oil Contaminated Soil from North-East India[J].Bioresource Technology，2007，98：1339-1345.
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