规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒与副猪嗜血杆菌混合感染的诊断及防治

摘要：通过剖检病理变化、细菌分离鉴定、药敏试验和RT-PCR等方法确诊了一例高致病性猪繁殖与呼吸综合征及副猪嗜血杆菌的混合感染，在此基础上提出和实施了相应的防治措施。

关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征；副猪嗜血杆菌；诊断；防治

中图分类号：S858.28 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）11-0005-04

广东某猪场有基础母猪约5 000头，在2012年1月17日发现一单元母猪发热嗜睡，皮肤发红，且抗生素治疗无效，发病率50%，病死率20%。然后陆续各阶段的猪均有发病和死亡，持续近2个月，其中保育猪的发病率为60%，平均死淘率为48%，经济损失巨大。主要症状表现为眼结膜发炎、眼脸水肿，皮肤发红，精神沉郁、咳嗽、喘气，耳、腹下呈紫色，皮下有点状出血，腹式呼吸。体温在41～42 ℃。部分猪便秘，粪便呈球粒状；部分猪腹泻；呕吐黄色浑浊物；死亡猪鼻腔出血；部分哺乳仔猪；保育猪有神经症状；怀孕母猪流产、死胎等。华南动物疫病检测中心对猪场送来的病猪进行实验室诊断并提出了防治措施。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 发病猪场送检病猪2头。

1.1.2 主要试剂及培养基 药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司；胰蛋白胨大豆琼脂TSA、胰蛋白胨大豆肉汤TSB、胰蛋白胨、酵母提取粉均购自Oxiod公司；NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）、新生小牛血清购自广州威佳科技有限公司；Taq DNA聚合酶、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、PrimeScript OneStep RT-PCR Kit、pMD18-T simple vector、premix EX Taq、DL2000DNA Marker、DH5α感受态细胞均购自宝生物工程（大连）有限公司；Gel Extraction Kit购自OMEGA 公司等；细菌DNA 抽提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；副猪嗜血杆菌特异性引物由上海英骏生物技术有限公司合成；猪繁殖与呼吸综合征病毒（Nsp2 1594～1680变异株）反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测试剂盒为北京世纪元亨动物防疫技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养及形态学观察 无菌条件下，用接种环取肺、肝、脾、肾、淋巴结，接种在TSA血平板、巧克力琼脂（含NAD和酵母浸膏），37 ℃培养18～24 h，然后对疑似副猪嗜血杆菌（HPS）挑单菌落进行纯化培养，对纯化后的菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察。

1.2.2 生化试验 将纯化的细菌接种到TSB（含有V因子）培养基中，振荡培养18 h后，吸取少量培养产物接种于生化管中，封盖，置于37 ℃温箱中培养24～72 h后，观察结果。

1.2.3 卫星现象检测 把副猪嗜血杆菌的可疑纯化菌落水平划线接种于普通血平板上，再挑取金黄色葡萄球菌在培养基上垂直划线，37 ℃培养24 h后，观察细菌生长情况。

1.2.4 药敏试验 挑单菌落接种到TSB兔血NAD液体培养基中培养至对数生长期，取100μL菌液涂于巧克力琼脂平板，使用K-B法进行药敏试验，根据NCCLS（2006）的标准判定。

1.2.5 细菌的PCR鉴定 采用16SrDNA通用引物（ 5′-AGATGATCMTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-TACGGH TACCTTACGACTT-3′）扩增16SrDNA，预期的片段大小为822 bp。

将分离的细菌抽提DNA，按照细菌DNA 抽提试剂盒说明书完成。抽提好细菌DNA后，进行PCR反应。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；56 ℃退火40 s；72 ℃延伸40 s；运行30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR完成后，取5μL PCR产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳，紫外投射仪中观察结果。

1.2.6 病毒性疾病的RT-PCR 检测及序列测定 按照猪繁殖与呼吸综合征病毒（Nsp2 1594～1680变异株）反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测试剂盒说明书，对病猪的肺组织进行RT-PCR，将目的片段胶回收纯化后，克隆入pMD-18T，送北京华大基因研究中心测序。

2 结果与分析

2.1 剖检病理变化

剖检发现，病猪均出现不同程度的间质性肺炎（图1），肺部出现明显肺炎病灶，小叶间隙加宽，气管和支气管有血性黏液渗出物。心包膜和胸腔大量积液（图2），心脏有大量出血斑，有明显的“绒毛心”现象。喉头出血（图3），淋巴结肿大，肾脏有少量出血点，胸腔及腹腔有纤维蛋白渗出。子宫黏膜表面粗糙钙化易脱落。

2.2 细菌分离培养及形态学观察

划线接种、过夜培养后，在TSA平板上可观察到菌落光滑、灰白色透明，直径大约0.5 mm、针尖大小表面隆起的菌落（图4）。经革兰氏染色后在显微镜下观察，形态多样，从单个球杆状到长、细长以及丝状菌体，为革兰氏阴性小杆菌（图5）。

2.3 生化试验

将分离纯化后的细菌进行生化试验，结果表明，分离菌株发酵蔗糖、葡萄糖、麦芽糖，对甘露醇、硫化氢、吲哚、氧化酶、赖氨酸生化反应均为阴性，触酶试验为阳性，结果符合副猪嗜血杆菌的特性。

2.4 卫星现象检测

试验发现离金黄色葡萄球菌划线生长区越近，其菌落越大、越多；反之，菌落越小，甚至无菌生长（图6）。

2.5 药敏试验

参照NCCLS（2006）标准以敏感（S）、中敏（I）、耐药（R）3种形式对抑菌圈大小进行判断。结果（表1）表明，分离菌对头孢噻呋、头孢噻吩、替卡西林棒酸、环丙沙星、诺氟沙星、头孢氨苯等高度敏感；对克林霉素、阿莫西林/棒酸2：1呈中度敏感；对氨苄西林、土霉素、阿莫西林、红霉素、丁胺卡那雷素、林可雷素等耐药。