均匀设计法优化重组大肠杆菌产酮基还原酶培养基

关键词：酮基还原酶；重组大肠杆菌；培养基优化；均匀设计

Key words： keto reductase； recombinant Escherichia coli； medium formulation optimization； uniform design

均匀设计（Uniform design，UD）是中国数学工作者方开泰等[7]于 20 世纪 70年代末提出的一种新的多因素多水平试验设计方法，其出发点是将试验点在试验范围内安排均匀分散，使试验点在数值积分范围内散布均匀，使布点离被积函数的各种值充分接近，所用试验点不多却能使积分值得到很好的近似[8]。它与正交设计、响应面方法等其他试验设计法的最大不同之处就在于，能从尽可能少的试验次数中揭示出因素对指标的影响大小和规律；能以最少的次数， 从多个因素中找出影响试验结果的各因素的主次和最优结果。本文首先利用单因素试验法找出适合重组大肠杆菌生产KR的发酵培养基成分，然后用均匀设计方法对培养基各组分添加量进行优化试验， 以提高KR的酶活并降低生产成本， 为大规模生产及应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种 重组大肠杆菌含有KR外源基因的质粒，由安琪酵母股份有限公司菌种室提供。质粒以氨苄抗性基因作为标记基因，以阿拉伯糖为启动子。

1.1.4 诱导剂溶液 L-阿拉伯糖溶液浓度为0.05 g・mL-1。

紫外可见光分光光度计：SP-754型，上海天普分析仪器有限公司；超声波破碎仪： 04711-45型，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 培养方法 种子培养方法：方法参见参考文献[9]。

1.3.3 检测方法 菌体量测定 ：发酵结束后，将稀释适当倍数的发酵液放置分光光度计中，在波长为600 nm下测量吸光值。

KR酶活检测：以COBE为底物， NADPH为辅酶，利用紫外可见光分光光度计在340 nm下，通过连续测定NADPH消耗量来计算酶活力，具体方法见参考文献[10]。定义酶活：在40 ℃，pH值为6.0条件下，每分钟消耗1 μmol NADPH所需要的酶量为1个国际单位（U）。

1.3.4 均匀设计及数据分析 本试验采用均匀设计优化其发酵培养基，试验数据采用 DPS 软件进行逐步回归分析[11]，筛选显著变量，建立回归方程，并通过回归方程求取极值，得到最优培养基组成。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对重组大肠杆菌的生长以及产KR的影响

2.2 不同氮源对重组大肠杆菌的生长以及产KR的影响

2.3 不同金属离子对重组大肠杆菌的生长以及产KR的影响

2.4 磷酸根离子对重组大肠杆菌的生长以及产KR的影响

由图4可知，pH值为7时，磷酸盐离子浓度对重组大肠杆菌的生长以及产酶的影响较小，根据测量结果可知，离子浓度在0.05～0.2 mol・L-1时KR酶活较高。反之，培养基的初始pH值对菌体繁殖以及产酶影响较大，结果显示pH 值7 为最佳初始pH值。

2.5 均匀设计优化

单因素试验已初步选出培养基的主要成分以及最优添加量。试验结果显示：选取甘油 10 g・L-1，酵母浸出物（FM888）以及酵母蛋白胨（FP101）7∶3混合物 40 g・L-1，七水硫酸镁 0.5 g・L-1用pH值为7，离子浓度为0.05 mol・L-1的磷酸盐配置基础培养基有利于菌体的生长以及酶活的提高。基于单因素试验，以KR酶活为响应值，利用均匀设计进一步优化培养基各成分的最优添加量。试验因素以及试验水平设计如表1。

用 DPS 软件均匀设计模块对表2的数据进行多元二次逐步回归分析，得出酶活与各因素关系的方程为：

此方程回归结果如表 3 所示。

3 结 论

参考文献：

[3] 朴文花. 掷袍酵母酮基还原酶（KR）在Pihcaipastorsi和E.coli中的表达[D]. 延边：延边大学，2001.

[4] Hideali Y， Sakayu S， Michihiko K，et al.A novel NADPH-dependent aldehyde reductase， catalyzing asymmetric reduction of fl-keto acid esters， from Sporobolomyces salmonicolor： purification and characterization[J]. Fems Microbiology， 1990， 70（1）： 45-48.

[5] Colleen A C， Robert A P， Micheal A M， et al.Purification， characterization， cDNA cloning and expression of a novel ketoreductase from Zygosaccharomyces rouxii[J]. Eur J Biochem， 2000，267（17）： 5 493-5 501.

[7] 方开泰， 王元. 均匀设计与均匀设计表[M]. 北京： 科学出版社，1994.

[8] 左斌 ，胡超 ，谢达平. 均匀设计对大肠杆菌产谷氨酸脱羧酶培养基优化的应用[J].湖南农业大学学报：自然科学版，2008，34（5）：531-533.