细胞摄取纳米材料引起的自噬反应

Abstract:Autophagy, a complex catabolic pathway, is bulk degradation of cytoplasmic components through the lysosome, which provides a highly dynamic quality control mechanism to maintain cellular homeostasis, and is also a protective mechanism in response to stress.A growing body of research suggests that autophagy is also activated upon internalization of engineered nanomaterials, most likely as a protective response to what is perceived as foreign or toxic.While activation of autophagy by nanomaterials can lead to enhanced clearance, it may also be associated with activation of cell death programs.This review described the mechanisms of autophagy activation in response to naturally occurring and engineered nanomaterials and provide a comprehensive analysis of the impact of nanomaterials on the lysosome-autophagy system and their functional consequences.

Keyword:Autophagy; Lysosomes; Nanomaterials; Autophagy-modulating effect;

哺乳动物细胞具有高度复杂和综合的信息网络系统， 调控基因组信息表达为不同生物学功能的分子组件。细胞的生理功能状态是整体所决定， 并且随着自身以及外界环境条件的变化而变化。哺乳动物细胞经过长期的进化， 可以通过高度精细的调控机制来应对外部因素的刺激， 以保持自身稳定。

近年来， 纳米技术领域的快速发展使得大量工程纳米材料已经进入生产和市场化阶段[1].由于纳米材料具有纳米量级 （1~100 nm） 尺寸， 可以与蛋白质、细胞膜和细胞等生物组分相互作用， 从而可能导致蛋白冠的形成、颗粒的包裹、胞内摄取以及会造成生物相容或排斥结果的生物催化反应发生[2].但是， 很少有人知道这种纳米材料与生物体的相互作用对细胞生理机能造成的影响。尽管纳米材料对人类和环境的潜在影响已经引起广泛的关注与担忧， 然而大多数研究仅侧重于阐明纳米材料的毒理学。另外根据现有体内体外的毒理学标准， 一些纳米材料虽然是无毒的， 可能不会导致病态或致命的结果， 但是其对机体生理机能的影响仍不能忽略[3].

哺乳动物细胞经过长期进化已经形成了严格的控制系统， 通过激活物质降解途径来防止异常物质的积聚。纳米材料一旦被细胞内吞， 它们就会被视为外来异物或有毒的物质， 细胞可以通过激活清除机制将其代谢和降解。研究已经证明不同大小和不同组成成分的纳米材料均能够激活细胞的自噬系统[4].纳米材料引起的自噬具有两面性， 一方面可增强细胞清除异物的能力， 另一方面也能引起细胞程序性死亡。另外由于纳米材料引起的细胞自噬会导致细胞负责降解的细胞器受损， 最终引起自噬通量阻塞。本文主要阐述了机体自然发生和工程纳米材料诱导发生自噬的机制， 并讨论了由纳米材料诱导的自噬激活所导致的生物相容或生物排斥相关的细胞标志物。

1、自噬

自噬 （autophagy） 通过降解细胞内蛋白到细胞器等一系列细胞组件来维持细胞稳态平衡。目前， 自噬主要分为3种： （1） 微自噬， 通过溶酶体直接吞噬细胞内多余材料进行降解； （2） 分子伴侣介导的自噬， 通过配体的特异性识别实现错误折叠蛋白的选择性降解； （3） 巨自噬， 指底物蛋白首先被包裹形成自噬小泡， 然后将其运送至溶酶体中实现降解的过程。纳米材料引起的自噬类型为巨自噬， 当纳米材料被细胞吞噬后， 被自噬泡包裹并运送至溶酶体中降解。

1.1 自噬体的成熟

1.1.1 自噬的诱导

自噬在多种环境状态下都可能被激活， 以维持细胞内环境稳态， 以避免细胞死亡。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 （the mammalian target of rapamycin, m TOR） 通过检测细胞内和细胞外营养物质， 能量水平和生长信号来调节细胞生长和增殖[5].当细胞处于应激状态， m TOR的活性被抑制， 一方面引起蛋白质合成受阻， 另一方面诱导自噬发生。自噬的发生需要众多自噬相关基因 （autophagy related genes, Atg） 的参与， 包括Unc-51样激酶 （ULK） /Atg1、Atg13、FIP200/Atg17和Atg101.正常条件下， m TOR与ATG1蛋白结合形成复合物， ULK1/Atg1激酶的活性被抑制， 进而自噬被抑制。应激状态下， m TOR与ULK1分开， 进而ULK1被激活， 从而促进自噬的发生。另外当细胞摄取外来异物发生胞内材料堆积时， 也会出现自噬的活化， 诱导自噬发生。

1.1.2 自噬体的形成

自噬体的形成主要包括双层膜的伸展和封闭两个阶段[6].底物被称为隔离膜或吞噬泡囊泡样结构包裹， 然后隔离膜延伸并包裹封闭胞浆成分形成一个双层膜。双层膜延伸包裹底物蛋白形成自噬体。在这个过程中Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶 （PI3K-Ⅲ， Phosphotidylinositol3-kinase-Ⅲ） 可磷酸化磷脂酰肌醇 （Ptdlns, Phosphatidylinositol） , 生成3-磷酸磷脂酰肌醇 （phosphatidylinositol 3-phosphate, PI3P） .PI3P在募集自噬相关蛋白中发挥重大作用。它可以用来招募自噬相关蛋白， 如Atg16L到分离膜， 参与自噬体的形成。

1.1.3 自噬体与溶酶体融合

自噬体形成后包裹需要降解底物的双层膜结构， 但是并没有酶的活性， 而是在形成后向溶酶体运动， 使二者融合， 最终在溶酶体中水解酶的作用下完成底物的降解。在哺乳动物自噬体与溶酶体融合过程中， 自噬体通过微管和动力蛋白-动力蛋白激活蛋白复合物而实现向溶酶体快速运动。另外， 其中微管充当自噬体快速运行的轨道， 在水解ATP产生能量的条件下， 促进自噬体向微管蛋白负极运动。抑制微管和动力蛋白后， 自噬体运动将会被抑制。

1.2 调节自噬的信号转导通路

1.2.1 TOR信号通路

转录因子EB （transcription factor EB, TFEB） 能够调节自噬体与溶酶体的生物合成与融合， 调控协同溶酶体表达和调控 （coordinated lysosomal expression and regulation, CLEAR） 基因的表达[6].在正常生理状态下， 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白激酶复合物1 （the mammalian target of rapamycin protein kinase complex 1, m TORC1） 位于溶酶体膜上， 另外能够磷酸化TFEB, 从而阻止其进入细胞核。但是在应激状态下， m TORC1从溶酶体膜上上释放出来， 进而转移TFEB进入细胞核， 活化CLEAR基因的表达[7].TOR可识别来自氨基酸、生长因子、糖、氧化水平和丝裂原等信号， 调控细胞内蛋白质的合成与降解。

1.2.2 Beclin相关调控途径

Beclin1是哺乳动物Atg6的同源蛋白， 也是机体调控自噬的核心分子。Beclin1通过BH3结构域与B淋巴细胞瘤-2 （B-cell lymphoma-2, Bcl-2） 的BH3结构域结合， 进而减少细胞内Beclin1的数量， 抑制Beclin1与紫外线抵抗相关基因 （UVRAG） 的相互作用， 进一步抑制Beclin1/Vps34复合物的形成， 从而抑制自噬。

1.2.3 压力应答效应

当细胞处于应激状态时， 往往通过调节自噬水平来维持细胞稳态平衡。但是， 当外界环境压力超过自噬能够调节的范围， 细胞就会启动自噬性细胞死亡。

2、纳米材料-自噬活化剂

2.1 天然纳米材料

自噬能够降解体内一些不溶的纳米级别的生物分子， 这些生物分子同样可以引起细胞自噬。自噬在机体内疾病发生和免疫系统中具有重要作用， 自噬参与异常蛋白的降解， 能够防止神经元内异常蛋白的积聚， 如帕金森病中存在核蛋白的聚集与自噬能力下降有关。而自噬过强会造成线粒体功能障碍， 导致亨廷顿舞蹈病的产生和亨廷顿蛋白的积聚。自噬损伤会导致蛋白质和脂质的积聚引起神经退化， 自噬活性增加能够增强机体对毒性材料的清除能力[16].因此如何控制自噬的度对人体健康十分重要。

自噬体的形成需要p62/SQSTM-1等特定的配体参与[8].p62调控自噬体对底物的包裹， 并参与降解过程。p62/SQSTM-1具有双官能团， 一方面可识别异常折叠蛋白的泛素化部位， 进而与异常蛋白结合形成复合物；另一方面能识别自噬体的LC3/Atg8.进而自噬泡将错误折叠蛋白包裹形成自噬体， 实现蛋白的特异性降解。除了p62参与蛋白质类材料特异性降解外， 目前发现还有其他自噬配体通过与p62相同的分子机制调节细胞器、细菌等底物的降解。

自噬在机体固有免疫系统和降解细胞内病原体中发挥巨大的作用[9-10].最新研究发现， 自噬也参与生物体抵抗外来病原体的入侵， 也被认为机体抵抗病原体入侵的第二道防线。病毒侵染机体引起自噬活化的分子机制尚不清楚， 可能与病毒感染机体的途径有关。由HIV-1[11]和副粘病毒[12]颗粒引起的等离子体膜改变能够诱导自噬。表明当机体受到病原体入侵时， 自噬会被激活， 通过溶酶体清除细胞内入侵的病原体发挥抗感染作用。

细胞能通过调控溶酶体降解底物， 活化TFEB, 激活溶酶体-自噬系统， 将细胞内材料经胞吐作用分泌出细胞外。另外， TFEB的过度表达会将胞内积聚的溶酶体和自噬体经胞吐作用降解， 从而缓解溶酶体积聚引起的疾病。但是， 有研究发现疾病和基因失活会引起自噬功能紊乱， 增强对蛋白的胞吐作用[13], 从而对机体造成损伤。因此， 自噬与胞外分泌是合作还是竞争取决于所处的不同生理状态。

2.2 工程纳米材料

工程纳米材料在药物传输、体内体外诊断等生物医药领域使用广泛。纳米颗粒由于其特殊的物理化学性质可与机体发生相互作用。研究发现纳米颗粒被细胞摄取后积聚在自噬体内， 可以促进自噬小体的形成， 进而诱导细胞产生自噬。Seleverstov等[14]首次发现量子点能够引起细胞自噬， 目前为止许多纳米材料已经被发现能够引起自噬， 包括二氧化硅、金纳米颗粒、-氧化铝、稀有氧化物、富勒烯等。这些纳米材料的组成和化学性质差异很大， 但是它们的颗粒大小却近似相同。因此纳米颗粒的大小是诱导自噬的主要原因。不同纳米材料由于物理化学性质的差异， 激活自噬的机制也不尽相同。另外， 对纳米材料表面化学活性区域的修饰作用会增加纳米颗粒空间复杂性， 这就需要我们去深入探讨以理解与自噬相关纳米材料的设计规则， 从而设计出高活性、低毒性的纳米材料。

3、细胞摄取纳米材料引起的自噬反应

尽管越来越多的证据表明， 溶酶体-自噬系统在细胞对纳米材料的适应性反应中起到关键作用， 但是纳米材料引起自噬的本质尚不清楚。自噬在保护细胞免受损伤和保持细胞稳定方面发挥重大作用。细胞摄取纳米材料后会引起细胞自噬， 这是由于细胞将纳米材料视为外来异物， 外来异物的堆积会激活机体的清除机制[15].研究证明纳米材料会引起细胞毒性， 包括溶酶体功能紊乱[16]、氧化应激， 线粒体损伤， 甚至干扰基因的调控[17].

细胞吞噬纳米材料激活溶酶体-自噬系统后， 可增强细胞对异物的清除， 或者导致下游信号途径的损伤， 阻塞自噬通量。银纳米粒子， 由于其突出的抗菌性能广泛应用于医疗设备， 它不仅能够激活自噬， 也能诱导细胞发生氧化应激引起细胞毒性。另外， 通过实验发现银纳米颗粒能够引起自噬体与溶酶体的融合， 但并不会促进自噬体的增加， 这表明纳米银粒子会阻塞自噬通量[18].因此， 纳米材料能够诱导自噬并不代表一定会增强细胞的自体吞噬能力， 相反当细胞过度摄取纳米颗粒， 会引起下游自噬通路的损伤， 进而影响自噬体与溶酶体的融合， 从而阻塞自噬通量， 造成细胞损伤。

3.1激活自噬清除能力

纳米材料能够引起TFEB的活化， 而TFEB能够促进自噬和溶酶体相关基因的表达[8], 因此提高TFEB的活性以增强机体对异物 （外来纳米材料、蛋白质和蛋白脂质体） 的降解是一种潜在的增强机体清除能力的策略[6,19].美国食品药品监督管理局 （FDA） 已认证2-羟丙基--环糊精赋形剂能够增强药物的稳定性和利用率。最近研究发现2-羟丙基--环糊精能够通过激活TFEB的表达进而增强对纳米材料清除[20].二氧化铈纳米粒子具有良好的生物性能， 具有清除自由基的能力， 可以保护辐射诱导的损伤和氧化应激， 而且还可以提高TFEB调节的自噬清除能力[21].

由于纳米材料能够诱导自噬， 因此递送纳米材料的系统也会受到损害。聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly （lactic-coglycolic acid, PLGA]携带抗肿瘤药物与自噬抑制剂[3-甲基腺嘌呤 （3-MA） 氯喹]联合给药， 能够显着增强多西紫杉醇治疗MCF-7乳腺癌肿瘤的功效。这是因为纳米载体能够激活自噬， 因此多西紫杉醇就会通过自噬被降解， 其药效就会显着下降[22].当联合给予自噬抑制剂， 纳米载体诱导产生的自噬就会被抑制， 其药物效果就会显着提升。因此， 调控纳米颗粒引起的自噬， 增强自噬对底物的清除能力， 这就需要我们在设计纳米材料时充分了解自噬与纳米材料之间的关系。然而我们对于纳米材料与自噬的相互关系知之甚少， 限制了纳米材料科学的发展。

通过调节纳米材料引起的自噬激活反应来增强纳米材料的载药能力或者解决其安全性问题， 依赖于纳米材料结构的细致设计。当前对纳米颗粒和自噬体系之间功能性相互作用的理解有限， 阻碍了我们理性设计具备可预测的自噬调节活性的纳米材料。一方面， 有人发现一种具有高亲和力的表面涂层多肽能够消除镧系元素纳米晶体引起的自噬反应。但有趣的是， 也有人发现将高亲和结合力结构部分与RGD细胞粘附结构域结合的双功能团多肽， 却能够强烈激活细胞自噬[23].用81层碳纳米管[24-25], 展示表面配体结构的高度多样性， 并从中筛选出能提高LC3加工处理的配体。但有趣的是， 用筛选出来的表面配体进行功能修饰的碳纳米管， 能够引起细胞自噬， 但仅有这些表面配体却不能激活细胞自噬， 这表明， 自噬激活是对细胞对纳米材料摄取后的一种反应， 自噬反应的具体性质取决于纳米材料和自噬-溶酶体系统的相互作用方式。

3.2 阻塞自噬通量

正常情况下， 自噬能够调节细胞稳态保持细胞存活， 但自噬过度会产生毒副作用引起细胞死亡。研究发现当细胞给予多聚物纳米材料[26]和氧化铁等纳米材料时， 其引起细胞死亡的同时， 细胞内自噬体含量也会增多， 表明自噬与细胞死亡存在联系。但证据表明自噬和细胞死亡存在因果关系仍然不足[5].纳米材料引起的自噬通量堵塞和自噬引起细胞死亡的分子机制尚不清楚。

自噬的降解依赖于多个细胞进程的协同合作， 最重要的是自噬体与溶酶体的融合。但是自噬体数量的增多并不代表细胞降解能力的增强。自噬通量的堵塞可能与自噬体与溶酶体的融合障碍有关， 也可能与自噬体本身存在缺陷导致溶酶体的积聚有关[27].研究发现许多纳米材料均可以阻塞自噬通量， 例如：富勒醇、银、稀有氧化物和金纳米颗粒[16].

细胞摄取羧酸盐碳纳米颗粒会引起自噬体积聚， 阻塞自噬通量进而导致细胞毒性。通过运用自噬抑制剂巴伐洛霉素A1处理细胞， 纳米材料经过胞吐作用分泌出细胞外， 自噬通量的阻塞现象会得到轻微减轻[28].由于大多数纳米材料不能通过细胞代谢途径被降解， 自噬调节的胞外分泌也许是细胞清除纳米粒子的一种途径， 来保护细胞免受纳米材料的损伤。

纳米材料引起的自噬通量阻塞也已经在医疗领域得到应用。纳米材料通过特异性识别靶向肿瘤细胞， 诱导肿瘤细胞发生自噬， 进而引起自噬通量阻塞， 也许是实现癌症精准治疗的新策略[29].已有研究发现氧化铁纳米颗粒能够引起人癌细胞死亡， 而对正常的肺成纤维细胞没有影响[16,30].另外， 以铁为内核、金作为外壳的纳米颗粒也能通过激活自噬降低肿瘤细胞的活性， 从而实现机体抗肿瘤反应[31].

纳米材料引起的自噬通量阻塞很有可能是通过扰乱溶酶体功能来实现。溶酶体完整性的缺失和溶酶体内酶的失活将会阻止溶酶体与自噬体的融合， 进而导致自噬体的过度堆积引起自噬通量堵塞。例如金纳米颗粒[16]和碳纳米管[31]会引起自噬介导的细胞死亡， 当细胞死亡时， 纳米材料在溶酶体中被发现。由此可以说明纳米材料会干扰溶酶体的功能， 进而引起细胞死亡。纳米颗粒引起溶酶体功能紊乱的机制尚不清楚， 有可能通过引起氧化应激[21]和溶酶体p H的碱化， 进而影响溶酶体膜的通透性引起溶酶体功能紊乱。最近质子泵的理论已经被提出， 阳离子纳米材料通过影响溶酶体的酸性环境， 进而影响溶酶体膜的通透性， 进而引起细胞死亡。另外， 当细胞用质子泵抑制剂预处理时， 会减轻阳离子聚苯乙烯纳米颗粒引起的细胞毒性， 说明纳米颗粒的细胞毒性与溶酶体膜通透性有关[16,32].

最后， 自噬体的转移取决于细胞骨架的完整性[33].纳米颗粒可以直接通过损害细胞骨架的完整性， 间接引起氧化应激进而改变细胞机制， 引起自噬通量阻塞。一般来说， 纳米材料和细胞的相互作用能极大影响机体的生理状态。

4、结论与展望

纳米材料科学是21世纪的一门新兴学科， 具有重大的应用价值和发展前景。现代工程技术的快速发展， 使得纳米材料在工业上广泛应用， 在生物医疗、航天、能源等高科技领域产生深远影响。目前市面上， 有超过1 600种纳米类材料消费品， 人类不可避免地要接触到这些纳米材料， 因此人们必须警惕这些纳米材料可能带来的潜在危险。大量的试验表明， 纳米材料可以通过内吞作用进入细胞， 我们可以通过控制纳米材料的粒子大小、荷电量和表面性质来控制其进入细胞， 但是上述理化性质对其他细胞进程的影响的本质尚不清楚。

控制纳米材料引起的自噬活化， 增强细胞对底物的清除和降解能力， 这就需要我们在设计纳米材料时充分理解纳米材料与自噬的关系。但是目前我们对于纳米材料与自噬的关系认识有限， 限制了纳米材料科学的发展。了解自噬与纳米粒子的相互作用， 对纳米粒子的设计有深远的影响， 将会为纳米工程师设计下一代安全的纳米材料应用于纳米治疗提供新的思路和方法， 推动人类医疗事业的快速发展。

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