检测高效液相色谱法测定消丸中绿原酸的含量

消疕丸是根据济南市中医医院名老中医经验方开发的制剂，由金银花、土茯苓、菝葜、山豆根、当归等多味药物组成，具有解毒、活血、养阴清热、祛风润燥的功效，用于治疗银屑病( 即牛皮癣) 。为有效控制该制剂的质量，参照《中华人民共和国药典》及相关参考文献，本研究建立了高效液相色谱法测定金银花和菝葜中绿原酸的含量，为消疕丸的质量控制提供依据。

1 材料

1. 1 仪器

LC-100 型高效液相色谱仪( 上海伍丰科学仪器有限公司) ，二极管阵列检测器( 岛津SPD-M20A) ，Arcus 5 型自动进样器( Exformma Technologies) ; FA2004 型精密电子天平( 天津天马衡基仪器有限公司) ; 双列六孔仪表恒温水浴锅( 龙口市电炉制造厂) ; DS3120 型超声波清洗器( Tianjin Do-ChromTechnology Co. ，Ltd. ) 。

1. 2 药品与试剂

消疕丸( 济南市中医医院制剂室提供，批准文号: 鲁药制字Z0180219，批号: 20160301、20160405、20160512) ; 绿原酸对照品( 中国药品生物制品检定所，批号: 110753200403) ; 甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2. 1 色谱条件与系统适应性考察

色谱柱为岛津WondaCract ODS C18色谱柱( 4. 6 mm 250 mm，5 m) ，流动相为甲醇-0. 2% 磷酸溶液( V ∶ V =30 ∶ 70) ，检测波长为327 nm，柱温为室温( 25 ℃) ，流速为1. 0 ml /min，进样量为20 l，理论塔板数按绿原酸峰计算应1 000。

2. 2 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品22. 0 mg，置于25 ml 棕色容量瓶中，加入甲醇适量，超声使其溶解，用甲醇稀释至刻度，作为对照品储备液。精密量取该储备液1 ml，置于50 ml 容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0. 45 m 微孔滤膜滤过，即得对照品溶液( 质量浓度为17. 6 g /ml) 。

2. 3 供试品溶液的制备

取粉碎后的消疕丸粉末1 g，精密称定，置于100 ml 具塞锥形瓶中，精密加入50% 甲醇50 ml，称定质量，超声提取30 min( 功率150 W，频率20 kHz) ，冷却后，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1. 0 ml，置于5 ml 容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0. 45 m 微孔滤膜滤过，即得。

2. 4 专属性试验

取除金银花和菝葜外的处方量药材，按消疕丸制备工艺及2. 3项下方法制成阴性对照溶液。按照2. 1项下方法进样测定，结果显示，阴性对照溶液在与绿原酸相应的保留时间处无色谱峰，表明处方中的其他组分对绿原酸含量测定无干扰，

2. 5 线性关系考察

分别精密量取2. 2项下对照品储备液0. 10、0. 15、0. 25、0. 40、0. 60 ml，置于10 ml 容量瓶中，分别加入50% 甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取20 l，按照2. 1项下方法进样测定，记录峰面积。以绿原酸进样量为横坐标( X) ，峰面积为纵坐标( Y) 进行线性回归，得回归方程Y = 4 106 X - 131 485( r = 0. 999 7) ，结果显示，绿原酸进样量在0. 176 ～ 1. 056 g范围内线性关系良好。

2. 6 精密度试验

精密量取2. 2项下对照品溶液20 l，按照2. 1项下方法进样6 次，测定峰面积。结果显示，峰面积的RSD = 0. 46%，仪器精密度良好。

2. 7 稳定性试验

取同一批( 批号: 20160301) 样品适量，按照2. 3项下方法制备供试品溶液，分别于室温( 25 ℃) 下放置0、2、4、8、24 h 时按照2. 1项下方法进样测定，记录峰面积。结果显示，RSD = 1. 13%，供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2. 8 重复性试验

精密称取同一批号( 批号: 20160301 ) 样品适量，按照2. 3项下方法制备6 份供试品溶液，分别按照2. 1项下方法进样测定，记录峰面积并计算含量。结果表明，绿原酸平均含量为4. 5 mg /g，RSD = 1. 02%( n = 6) ，本方法重复性良好。

2. 9 加样回收率试验

精密量取已知绿原酸含量的消疕丸样品溶液共9 份，每份2 ml，3 份为1 组，分别置于10 ml 容量瓶中，每组依次精密加入绿原酸对照品溶液( 质量浓度为88 g /ml) 1、2、3 ml，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0. 45 m 微孔滤膜滤过，按照2. 1项下方法进样测定，记录峰面积并计算绿原酸回收率，

2. 10 样品含量测定

取3 批消疕丸样品，分别按2. 3项下方法制备供试品溶液，再按2. 1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并代入线性方程计算含量。结果显示，3批供试品的绿原酸含量分别为4. 52、4. 26、4. 38 mg /g。

3 讨论

银屑病属于中医白疕的范畴，中医药治疗银屑病历史悠久。研究结果表明，土茯苓为治疗银屑病的要药; 金银花、土茯苓为治疗银屑病的常用组合; 而当归、土茯苓组合用于斑块型银屑病有不同的生物学通路，具有协同作用;菝葜对银屑病的治疗作用也得到了临床验证; 山豆根与土茯苓配伍用于治疗银屑病可起到减毒增效的作用。济南市中医医院名老中医经验方消疕丸组方科学、配伍合理，其疗效已得到现代临床研究的证实，为进一步深入开发，首先应提高其质量控制水平。

消疕丸处方中金银花和菝葜都含有绿原酸，故以绿原酸含量为指标，进行高效液相色谱法测定研究。在实际生产中，采用70% 乙醇提取可提高金银花药材中绿原酸的提取率，但消疕丸是原药粉压片，不存在提取率的问题。为方便高效液相色谱法测定，本研究参考《中国人民共和国药典》中的方法采用50%甲醇为溶剂制备供试品溶液，而结果表明，超声提取30 min 已达最大提取率。《中国人民共和国药典: 一部》( 2015 年版) 规定按干燥品计算金银花中绿原酸的含量应不低于1. 5%，而帅丽乔娃、潘永芳等均研究了菝葜中绿原酸的提取工艺，结果显示，绿原酸的平均提取率分别为0. 93%、1. 32%。根据金银花和菝葜在本方中的处方量，计算消疕丸中绿原酸的理论含量约为0. 45%，实测数据与此相符，考虑到饮片质量可能存在的差异及制剂工艺等因素对含量的影响，建议将消疕丸质量标准定为绿原酸含量不低于0. 4%。

随着药品再注册要求的不断提高，为保障临床用药安全有效，从根本上提高医疗机构制剂质量控制水平的工作势在必行。一方面，质量是生产出来的，李茜等将品管圈活动应用于医院制剂生产质量的持续改进中，优化了工艺流程、提高了生产效率，获得了较好的成效; 另一方面，检验是保证质量的重要防线，在进行质量标准提高工作的过程中，要结合各品种的具体情况，并参考《中国人民共和国药典》及有关文献，严格进行方法学验证，以科学严谨的态度做好质量标准提高工作，使医院制剂更好、更安全地服务于临床。本研究建立了消疕丸中绿原酸的HPLC 含量测定方法，该方法简便、准确、重现性好，可有效控制消疕丸的质量。