产甲壳素酶菌株的筛选与诱变

摘要：以胶体甲壳素作为惟一碳源，从自然界微生物中筛选并诱导到一株产甲壳素酶活性较高的菌株，经16S rDNA鉴定为Aeromonas sp.。并以该菌株作为出发菌株，经过一次紫外诱变，酶活是初筛菌株的1.48倍。再经过二次紫外诱变或者紫外-LiCl复合诱变，酶活分别是初筛菌株的3.16和3.87倍，最高酶活达到3.48 U/mL。最后通过连续传代培养，确定了菌株HMX-16经过紫外和复合诱变后突变性状稳定性良好。

关键词：甲壳素酶；紫外诱变；紫外-LiCl复合诱变；产酶活性

Abstract： A chitinase-producing strain was isolated and induced from various wild type microorganisms with colloidal chitin as the sole carbon source， and identified as Aeromonas sp. by 16S rDNA. After first ultraviolet （UV） mutagensis， the highest chitinase production of the mutated strain was increased by 1.48 times. After the second UV mutagenesis or UV-LiCl mutagenesis，the highest chitinase activity were increased by 3.16 and 3.86 times. The highest activity was increased to 3.48U/mL. The strain HMX-16 obtained with the best activity had good genetic stability after UV and UV-LiCl mutagenesis.

Key words： chitinase； UV mutagenesis； UV-LiCl mutagenesis； chitinase production

甲壳素酶（Chitinase，EC.3.2.1.14）是一类能催化降解甲壳素β-1，4？蛳糖苷键的水解酶，可以根据其酶切位置不同，分为内切甲壳素酶和外切甲壳素酶，外切甲壳素酶可分为甲壳二糖酶和N-乙酰氨基葡萄糖酶。甲壳素酶广泛存在于动物、植物以及微生物（细菌、放线菌、真菌）中[6]，据统计，迄今已发现约50个属近100种甲壳素酶产生菌[7-9]，在植物病虫害防治和甲壳素生物资源利用等领域有广泛的应用前景。目前，虽然已经从多种微生物中分离出甲壳素酶，但大多数产酶能力都较低。而诱变育种是筛选菌株最常用的方式之一[10，11]。紫外线辐照是一种较为常用的物理诱变方式，操作方便、安全，没有化学诱变剂毒性，对原核生物而言是一种比较好的诱变因素。氯化锂是一种碱金属卤化物，单独使用是一种弱诱变剂，但可协同作用来提高诱变效果。

本研究采用透明圈法从自然界微生物中筛选到一株产甲壳素酶活性较高的菌株，采用物理诱变、复合诱变处理，最后通过连续传代培养，筛选出一株产甲壳素酶活性较高并稳定性良好的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.3 培养基 10 g/L胶体甲壳素和含其他培养基成分的水溶液分开灭菌，使用前等体积混合。

2）二次紫外诱变。选取一次紫外诱变酶活最高的菌株作为出发菌株，重复一次紫外诱变操作。

3）紫外-氯化锂复合诱变。选取一次紫外诱变酶活最高的菌株作为出发菌株，以二次紫外照射中最有可能得到发生正突变的时间对菌株进行照射，之后进行适当梯度的稀释涂布于含氯化锂培养基的平板，挑取透明圈直径与菌落直径比值相对较大的菌株进行酶活测定。

1）Schales试剂制备：称取53 g碳酸钠，溶解于800 mL 超纯水中，加入0.5 g铁氰化钾，溶解后用去离子水定容至1 000 mL。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选结果

采集50多个土壤和污水样品，采用以胶体甲壳素为惟一碳源的初筛平板进行初筛，平板透明圈如图1所示，命名为X0。将所得菌株进行摇瓶发酵培养复筛，以胶体甲壳素为底物通过测定甲壳素酶活，得到一株产甲壳素酶活性较高（0.9 U/mL）的菌株，证明甲壳素酶的存在。对该菌株进行16S rDNA鉴定，初步鉴定为气单胞菌属的一种（Aeromonas sp.）。

2.2 一次紫外诱变结果

2.3 二次紫外诱变结果

以一次紫外诱变酶活最高的菌株UV1-7为出发菌株，紫外时间选择二次紫外诱变的15 s。菌株经过紫外照射后，将菌液涂布于LiCl平板上。恒温培养箱中30 ℃ 培养3 d后，挑取C/H较大的30株菌，接入斜面培养基，之后进行酶活测定，其中有9株菌株产的甲壳素酶活性较高，结果如表3所示。由表3可知，UVL-7所产酶的活性最高（3.48 U/mL）。

2.5 遗传稳定性试验结果

3 小结

参考文献：

[3] LIANG T W， CHEN Y Y， PAN P S， et al. Purification and chitinase/chitosanase from Bacillus cereus and discovery of an enzyme inhibitor[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2014， 63：8-14.

[9] ESCOTT G M， HEARN V M， ADAMS D J. Inducible chitinolytic system of Aspergillus fumigatus[J]. Microbiology， 1998，144：1575-1581.

[13] 张 克，旭陈宁，张 蓓，等.代谢控制发酵[M].北京：中国轻工业出版社，1998.