小儿化毒系列制剂中非法添加松香酸的检测方法讨论
小儿化毒系列品种分为散剂和胶囊剂两种剂型。处方由人工牛黄、黄连、天花粉、川贝母、乳香(制)没药(制)和冰片等十二味药组成，具有清热解毒，活血消肿之功效。其中乳香、没药均为进口药材，价格昂贵，为降低成本，市面上掺伪现象屡见不鲜。其中，最常见的掺伪方式是将松香酸添加到乳香和没药中，利用松香酸的特殊香气，以次充好，或以假乱真。松香酸是松科松属植物中渗出的油树脂经蒸馏或提取，除去挥发油后所余的固体树脂，具有毒性。因此，有必要对药品中是否非法添加松香酸进行检测。现已有采用HPLC-UV 法检测中成药中乳香及没药中是否掺有松香酸的报道，但能排除假阳性干扰的检测方法较少，故本文中除采用HPLC-UV 法对松香酸进行检测外，还采用了HPLC-DAD 法和HPLC-MS 法对其检测阳性结果进行进一步确证。
1 仪器与试药
1.1 仪器
岛津LC-2010 高效液相色谱;高效液相色谱- 质谱联用仪(Thermo Ultimate 3000 液相色谱仪;LCQFleet质谱);岛津SPD-M10AVP 检测器;ThermofisherC18 色谱柱(150 mm2.1 mm，5 Aglilent C18 色谱柱(250 mm4.6 mm，5 Kiomosil C18 色谱柱(250 mm4.6 mm，5 Techmate C18 色谱柱(250 mm 4.6 mm，5 m)。
1.2 试剂与试药
甲醇、甲酸、四氢呋喃为色谱纯，其余试剂均为分析纯。松香酸(北京振翔工贸有限责任公司，批号：514-10-3);乳香酸(中国药品生物制品检定所，批号：111760-200601)。小儿化毒制剂均为国家药品评价抽验样品。
2 方法与结果
2.1 高效液相色谱法
2.1.1 色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈- 四氢呋喃-0.1% 甲酸(45:25:30)为流动相;流速：1. 0 mLmin-1;检测波长：241 nm;柱温: 30℃;进样量：10 L。
2.1.2 溶液的配制
取松香酸对照品适量，加乙醇制成每1 mL 含10 g 的溶液，作为对照品溶液。取11- 羰基-- 乳香酸对照品适量，加乙醇制成每1 mL 含4 g的溶液，作为参照溶液。取小儿化毒散(胶囊)取样量0.6 g，精密加入乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理20 min 后，放冷至室温，再称定重量，用乙醇补足减失重量，取上清液，用微孔滤膜(0.45 m)滤过，取续滤液作为供试品溶液。取原药材，照处方量折算后，分别制成缺少乳香药材和没药药材的样品，按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
2.1.3 专属性实验
取松香酸对照品溶液，参比溶液及阴性对照溶液各10 L，按2.1.1 项下条件试验。结果表明阴性样品无干扰，专属性良好。
2.1.4 检测限
取松香酸对照品适量，配制成浓度为1.286 gmL-1 的对照品溶液。另取供试品0.6 g，乙醇定容至25 mL。上述两种溶液各取10 L，加入液相色谱仪。得到对照品信噪比为8.7。根据以下公式计算得出仪器检出限(IDL)为4.43 ng，方法检出限(MDL)为18.4 gg-1。IDL=MDL= IDLK3QI/NVW式中V 为进样体积，K 为稀释倍数，W 为取样量，Q为进样量，I/N 为信噪比。
2 .1. 5 耐用性
用不同品牌十八烷基键合硅胶色谱柱3 根，对供试品溶液和对照品溶液测定，记录色谱图，结果样品色谱峰分离度，理论塔板数，均能满足要求，耐用性良好。
2.1.6 仪器精密度
取浓度为12.86 gmL-1 的松香酸对照品溶液2.1.1 项下条件连续5 次，由峰面积计算精密度，RSD 为1.2 %(n=5)，表明仪器精密度良好。
2.1.7 线性
精密量取松香酸对照品贮备液适量，加乙醇分别制为浓度为2.572、6.43、12.86、19.29、25.72、32.15 gmL-1 的溶液，分别取10 L 注入液相色谱仪，得到色谱峰面积，以进样量为纵坐标，以峰面积为横坐标，绘制标准曲线。结果表明进样量在25.72~321.5 ng之间，呈良好的线性关系，回归方程为Y=0.038 1X+1.698 1，相关系数R2=0.999 7。
2.1.8 测定
取小儿化毒制剂样品，按2.1.2项下方法制备，按2.1.1项下色谱条件对5 家生产企业的共56批次样品进行检测，结果有1 家生产企业的全部5 批样品均检出松香酸。
2.2.1 色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈- 四氢呋喃-0.1% 甲酸(45:25:30)为流动相;流速：1. 0 mLmin-1;检测波长：210~260 nm ;柱温: 30℃;进样量：10 L。
2.2.2 确认
取已检出松香酸的样品，按2.1.2项下方法制备供试品，分别取供试品溶液以及松香酸对照品溶液10 L，注入高效液相色谱仪，进行光谱扫描，结果表明供试品吸收光谱与松香酸对照品吸收光谱相似度为0.999 9(图2)，均在保留时间t=13.66 min 处有最大吸收，最大吸收值波长为241 nm，检出松香酸。供试品与对照试剂相似度比较结果。
2.3 HPLC-MS 验证
2.3.1 色谱与质谱条件
Thermofisher C18 色谱柱(150 mm2.1 mm，5流动相为乙腈- 四氢呋喃-0.1% 甲酸(45:25:30);流速：1. 0 mLmin-1;检测波长：241 nm;柱温:30℃;ESI- 扫描：毛细管电压3.0 KV，锥孔电压40 KV，源温度150℃，毛细管温度350℃，扫描范围100~1 000 m/z。
2.3.2 验证
取已检出松香酸样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，取供试品溶液1 L 及对照品溶液5 L，注入高效液相色谱- 质谱联用仪，进行测定，结果供试品与松香酸对照品均在保留时间t=6.74 min 处出现相应的色谱峰，且具有相同的质谱特征(图3)。可以判定样品中含有松香酸。
3 讨论
本实验建立的高效液相色谱方法能够有效地对小儿化毒制剂中非法存在的松香酸进行检测，简便、快速，准确。用此法对56 批小儿化毒制剂进行检测, 共发现5 批存在非法添加。表明目前小儿化毒制剂中存在松香酸非法添加现象，鉴于现行标准无法检测小儿化毒系列制剂中松香酸的存在，此方法可作为补充检验。DAD 光谱扫描可有效的避免假阳性结果的出现。若供试品色谱中，出现与松香酸对照品色谱中相应位置的色谱峰，采用DAD 检测器比较相应色谱峰在210 ~260 nm 波长范围的紫外- 可见吸收光谱，若吸收光谱相同，均在2412 nm 显示最大吸收;且该色谱峰面积大于11- 羰基-- 乳香酸参照溶液色谱峰的峰面积值，则视为阳性检出。
HPLC-MS 技术将液相色谱的高分离效能与质谱对结构解析的强大功能结合起来，近年来随着各种离子化技术的不断出现，HPLC-MS 技术已广泛应用于医药领域，在中药及中成药非法添加方面亦起着重要的作用。HPLC-MS 法的进一步验证，能准确、可靠地判断小儿化毒制剂中是否含有松香酸类物质，可为小儿化毒制剂质量标准完善提供参考，进而为监管该药品质量提供技术支持。