浅析蓝藻生物工程

[论文关键词];蓝藻生物；系统分类；反应过程

[论文摘要];文章对蓝藻生物工程进行了研究和分析，希望有助于改善我们对相关问题认识和理解。

因此，对水华生物的准确鉴定、快速检测和预警预报已成为当前水华研究领域的热点问题，并具有重要的理论和实际意义。传统的藻类学鉴定方法是通过形态学的观察来划分的,形态学标准往往使检测样本中的一些种不能被辨别出,在水华发生的过程中,细胞的外型,产毒能力会发生变化,即使是在实验室培养条件下,不同氮源蓝藻的外形也会发生变化。目前各种新的检测技术在逐步建立,已有检测水华蓝藻产毒特性的全细胞PCR检测法以及依据16S rDNA基因保守区域设计引物用PCR方法检测蓝藻和微囊藻存在的报告。

1. 蓝藻系统分类研究

传统的蓝藻分类和系统发育树的建立是基于对其表型的比较分析，然而表型是基因和相互作用的结果，基因型相同的个体在不同的环境下可能表现出显著的表型差异，因此传统的分类方法可能受环境影响，而给分类和系统发育研究带来不确定性。分子系统学就是避开生物形态结构差异的干扰，直接通过检测生物体内大分子所包含的稳定遗传信息，定量描述、分析这些信息在分类、系统进化和遗传多样性研究上的作用，从而在分子水平上解释生物多样性、系统发育及进化规律的一门学科DNA分子作为遗传信息的直接载体，个体中的每个体细胞都有相同的遗传信息，因而能较为准确地反映出各个物种问的系统发生关系。根据DNA序列所含有的遗传信息来进行分类及系统进化等研究已成为分子系统学研究的一个重要途径近年来，DNA序列分析广泛地被用于生物遗传多样性分析和生物类群之间存在的种属关系以及生物类群的系统关系分析。

2. 蓝藻基因工程研究

基本分为五大类： 藻类质粒和限制内切酶研究、 藻类内源基因的研究、藻类外源基因的表达、藻类毒素监测和藻类监测。

目前，已经出现检测水华蓝藻产毒特性的全细胞PCR 检测方法 以及依据16S rDNA 基因保守区域设计引物用PCR 方法检测蓝藻和微囊藻存在的报告，以及选取的针对蓝藻和微囊藻的16S rDNA 基因保守区域的特异性引物和针对微囊藻毒素基因 mcyB的一对特异性引物，试图建立一种可以快速一次性得到这些信息的全细胞多重PCR方法，从而可以为长期大规模快速监测地表淡水水体提供一种有效手段。

3. 藻类基因工程的研究技术及方法

主要分以下三大类：转移的载体系统、藻类基因克隆的研究、藻类的遗传转化

4. 藻细胞基因组DNA提取模板制备

采用早先1988年Porter 的方法，但是这个方法太古早，虽然可行，但是对于多项因素以及杂质的干扰，细胞破除

的时间以及获得的基因的利用度对于中国现状的实验来说有待加强。

目前研究人员用于模板制备的方法基本有微波法、CTAB法、SDS法、水浴法等，但是由于地域、选择的藻类的不同、实验方法以及目的的不同，研究人员都会在基本实验方法基础上稍加改动以优化实验。

5. PCR反应条件以及反应过程

PCR扩增是实验的关键。PCR过程的优劣直接关系到实验成功与否。PCR反应中任何一种因素的变化，都有可能影响扩增结果。PCR扩增条件优化主要包括以下几个方面: 使用对比筛选过的引物令其具有良好的特异性、优化的Taq酶浓度、优化的Mg2+浓度、优化的最佳退火温度、优化的循环时间、优化的循环次数。甚至对不同研究目的，不同扩增仪器，不同公司和同一公司不同批次的试剂都应系统的摸索反应条件，优化反应体系。最终筛选出PCR扩增的总体最佳条件组合以及排除各种干扰项，并在此相对最佳条件下进行PCR法检测蓝藻的最低限量研究用以确定PCR法的检测反应灵敏度。

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① Taq酶活力的有无、高低直接关系着扩增结果。Taq酶的用量一般为0.5一3.0U。Taq酶的活力过高可能导致非特异性扩增，过低则酶活不足而导致扩增条带太弱。

② Mg2+主要作用是作为Taq酶的辅助因子，其浓度过低或过高都会影响Taq酶的活性。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低;浓度过高对酶也有抑制作用。较低的Mg2+浓度扩增有较高的特异性，过高会导致非特异扩增产物的积累，背景模糊。

③ 变性温度过低，不能使靶基因模板和PCR产物完全变性，就会导致PCR扩增失败。变性温度一般在92一95℃，更高的温度可能更有效，尤其对富含G一C的片段，但Taq酶在95℃可保持活力35min左右，高温变性时间过长会导致Taq酶活力降低。

退火温度决定了反应的特异性。在一定范围内，退火温度越高，PCR扩增特异性越高;但退火温度过高，引物与模板DNA亲和力太小甚至不能结合，会导致扩增产物量降低。

延伸温度:现有的Taq酶最佳活力温度范围是65一75℃，一般72℃时酶活力最高。因此在扩增反应中，延伸温度采用72℃。不合适的延伸温度不仅影响扩增产物的特异性，而目.也会影响其产量。延伸时间取决于靶序列的长度和浓度，延伸时间过长会导致非特异性带的出现。

④ 循环次数决定扩增程度。在其他参数己优化的条件下，最适循环次数取决于靶序列的初始浓度，过多的循环增加非特异性扩增的数量和复杂性(平台效应);循环次数太少，PCR产物量就会极低，扩增带太弱甚至扩增阴性。PCR一般采用25一45个循环进行扩增

6. PCR扩增时若操作不严格，很可能导致假阴性和假阳性结果

假阴性主要是模板液中某些物质，如残留的极少量培养液成分、菌体蛋白等抑制了PCR反应;或者是pCR体系液中某成分失效所致，如dN丁P反复冻融降解、Taq酶活性下降、引物部分降解等都可能导致假阴性的结果。

假阳性的造成，前人认为主要是扩增产物污染和标本间的交叉污染。扩增产物污染既是最严重，也是最容易发生的一种污染。因为经过一次标准的PCR扩增，就可以产生大量的扩增产物，即使最微小的气溶胶微滴(10一6uL)，也可含有大量的靶分子。

由于PCR具有极高的灵敏性，在试验设计中，研究人员们注意选用较低的Mg2十浓度和引物浓度、较高的退火温度，可以一定程度上防止非特异性扩增和假阳性的产生。假阳性的原因在于核酸污染，而核酸污染来自两方面:扩增产物污染以及样品间DNA交叉污染。目前报导的解决扩增产物污染方法有两种:尿嗯陡一N一糖基化酶解法和8一甲氧补骨酷素光化学法。但这两种方法并不能防止样品间DNA交叉污染。为了尽量避免假阳性的出现，规范实验程序可能更有实用价值，从实验条件到操作上都严格要求

参考文献 [2] 施定基. 蓝藻分子生物学和基因工程研究在我国的发展[J].中国科学院植物研究所.北京100093

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