基于纳米材料的表面辅助激光解吸离子化质谱探究
1 引言
MALDI-MS 是由Hillenkamp 课题组引入的一种软电离质谱技术，可以快速解吸高分子量物质，无碎片产生或伴有少量碎片，具有卓越的检测精度和灵敏度，是一种重要的生物分析工具。其测试原理是，当用一定强度的激光(337 nm 的N2激光) 照射样品与基质形成的共结晶薄膜时，基质从激光中吸收能量，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子发生解吸电离，依据样品的质荷比(m/z) 的不同来进行检测，并测得样品分子的分子量。然而，由于该方法所使用的有机小分子基质也发生电离，其本身的背景信号对低分子量分析物会产生一定的干扰，使其很难应用于小分子量化合物( 700 Da) 的分析。其次，MALDI-MS 的测试条件要求比较高，待测物需要与基质可混溶，并且它们必须共结晶。因此，存在不均匀且非常复杂的共结晶现象，进而影响基底表面信号的重复性。另外，由于选择合适的基质及样品制备过程的优化也是一个不断实验探索，费时费事的过程，因此，促使人们去发展一类避免有机基质干扰的LDI-MS 技术。最近，孔祥蕾等发表了一篇题为适用小分子化合物MALDI 分析的基质研究的综述文章，对这方面的工作做了全面而系统的介绍，包括无机材料、有机分子、离子液体等作为传统基质的替代品发挥了能量转移作用，另外还涉及到了基质信号的抑制及小分子分析物的衍生化等。
将纳米材料应用于LDI-MS，促进了免有机基质LDI-MS 的发展。与传统的基质辅助技术相比，用于LDI-MS 的纳米材料不会发生电离，使得该方法的应用范围扩展到小分子的分析。另外基于纳米材料的LDI-MS 还具有样品制备简单、高耐盐性及能够实现对待测物的定量分析等优点。
最初将纳米材料引入到LDI-MS 中的是Tanaka课题组，其使用30 nm 钴纳米粒子的甘油悬浮液实现了对蛋白质及聚合物的检测。随后，Sunner 课题组使用微米尺寸的石墨颗粒和活性炭的甘油悬浊液对多肽进行质谱分析，并提出了基于纳米材料的表面辅助激光解吸离子化质谱(SALDI-MS) 的概念。实际上，SALDI-MS 与MALDI-MS 的引入均出于同一时代，只是当时后者的广泛应用和迅速发展致使前者的发展受阻。直到后来Wei 课题组提出基于多孔硅(DIOS) 的免基质LDI-MS，其证实了纳米结构表面与激光解吸电离增强的关系，促使人们探索不同纳米材料在激光解吸电离质谱中的应用。与有机基质所起的作用类似，这些纳米材料能吸收激光能量，可以有效的解吸和软电离待测物，而只产生很少的碎片。另外，基于纳米材料的SALDI-MS 有效地克服了MALDI-MS 中两个主要问题:由于共结晶薄膜所造成的甜点效应会引起样品分析时点与点之间重复性较差的问题，以及在低分子量区有较高的背景干扰。最近，随着纳米技术的发展，人们选择了不同组成、形状、尺寸的纳米材料来进行质谱方面的应用。由于种类繁多，我们根据材料的材质，分四大类( 碳纳米材料、硅纳米材、其他材料的纳米粒子及纳米杂化多孔材料) 对研究较多的纳米材料进行了评述，并详细讨论了最近十年的研究进展。
2 不同纳米材料在SALDI-MS 方面的应用
2. 1 基于纳米碳材料的SALDI-MS 分析
碳材料可以吸收紫外光，然后将能量传递给附近的待测物以促进其解吸电离，并且在低分子量区域不存在基质干扰。基于此，现在很多碳材料已被应用于小分子量物质的LDI-MS 分析。最早被用于SALDI-MS 分析的碳材料是石墨，可以在免有机基质的条件下实现对部分分子的质谱分析，如多肽、低聚糖，及合成的聚合物。金刚石是碳材料的另一个同素异形体，在其表面修饰上一些特殊的官能团，如羰基、羟基、醚和酯等，可被用于特异性结合血清中的肽和蛋白质，如与癌症相关的生物标志物的免有机基质的LDI-MS 检测。另外，羧基和胺基化的金刚石纳米晶体已被成功应用于分离、浓缩及纯化蛋白质和寡核苷酸。
纳米碳材料单位质量的比表面积较大，反应能力强，选择性好，负载能力高，有利于提高检测的动态范围。并且大部分的碳基纳米材料能对光有吸收，同时也是良好的电导体，这对于有效的能量传递和分散是至关重要的。现在，各种形式的碳纳米材料(包括富勒烯、碳纳米管及石墨烯) 在SALDI-MS方面都得到了广泛应用。鉴于碳材料在该领域的研究较多，这里我们重点对具有纳米结构的碳材料，如富勒烯、碳纳米管、石墨烯等在这方面的工作做一综述。另外，一般使用的石墨类碳材料会在LDI-MS分析过程中产生碳簇Cn- 干扰离子峰，严重限制了对m/z 300 的小分子的分析，相比而言，基于上述三类碳纳米材料的使用在一定程度上消除了该不利方面。
2. 1. 1 基于富勒烯的SALDI-MS 分析
富勒烯(C60)是由60 个sp2 杂化的碳原子通过20 个六边形和12 个五边形连接而成的具有30 个碳碳双键的足球状直径约1 nm 的空心对称分子，具有非常高的对称性。富勒烯是一个大共轭体，其化学和物理性质表明它是缺电子烯烃而非富电子的芳香体系。由于其独特的性质，在生物技术领域有广泛的应用。Willett 课题组通过预涂富勒烯薄膜，第一次将C60作为能量吸收分子用于激光解吸电离分析。相比有机基质，富勒烯的结构对于激光光子的吸收更为有效，其光吸收波长范围更广。因此，待测物解吸过程所需要的激光强度低于传统的有机基质。此外，富勒烯与待测物之间只需很小的摩尔比就获得较高灵敏度。实验数据表明，富勒烯/待测物的摩尔比在低于100∶ 1的情况下仍足以获得合理的质谱图，而标准有机基质则需要1000∶ 1。谢建台课题组选用由6 个带负电荷的磺酸共价键合衍生化的富勒烯进行免有机基质的LDI-MS 分析。这些衍生物在紫外范围内具有很强的光吸收，这使得它们适于低分子量化合物的免基质分析。此外，由于其疏水性和负电荷性质，可以选择性富集待测物如氨基酸、多肽或蛋白质，从而提高了其检测灵敏度。
2. 1. 2 基于碳纳米管的SALDI-MS 分析
碳纳米管是由sp2 和sp3 杂化状态的碳原子混合组成的一维量子材料，其径向尺寸为纳米量级(1 ～ 50 nm)，轴向尺寸为微米量级(1 ～ 20 m)。邹汉法课题组首次报道使用由电弧放电方法得到的碳纳米管进行SALDI-MS 检测。相比MALDIMS，基于碳纳米管的SALDI-MS 表现出较高的灵敏度，能以较低的激光功率阈值检测低至50 amol 的小分子。Chen 等通过在NaH 处理的阳极氧化铝模板上滴加高浓度的柠檬酸盐缓冲液制备得到的碳纳米管实现了对多肽和蛋白质溶液的质谱检测。并且柠檬酸盐缓冲剂作为质子源有效抑制了碱金属离子加合物的产生。该方法对分子量较小的多肽和细胞色素c 检测限可以达到fmol 级。另外，通过柠檬酸盐与待测物之间的静电相互作用和疏水作用，碳纳米管还可以从含有干扰物质的溶液中将待测物质进行预浓缩，起到富集作用，进一步增大了该方法的检出限。与此类似，邹汉法等使用未功能化的碳纳米管可以从混合物中来选择性提取小分子，进而进行SALDI-MS 表征。
使用碳纳米管进行SALDI-MS 分析存在两个缺点:首先，碳纳米管不能与样品板共价结合，因此会从样品板表面飞起污染飞行时间检测器。在点样前使用聚氨酯粘结剂固定碳纳米管的方法，可以有效地防止碳纳米管飞离样品板的表面。该方法可以实现溶液中小的多肽和中性碳水化合物(其一般用激光解吸电离方法很难检测) 以及尿样中的葡萄糖的检测。除此之外，固定化可以允许快速点样技术如电喷雾样品沉积，这样可以不用寻找甜点，也促进了源后衰变实验。其次，碳纳米管很难溶解在溶液中，这限制了其在蛋白组学分析中的使用。为了使得改进的碳纳米管可以分析环境液体，邹汉法等探究了由硝酸化氧化制备的氧化碳纳米管在SALDI-MS 中的应用。由于氧化碳纳米管具有亲水性，使得样品结晶更均一，激光点到点的重现性得到改善因而可以进行定量分析。并且由于氧化表面羟基和羧基存在，其可为待测物提供质子，因此，当使用氧化碳纳米管进行LDI-MS 分析时无需再添加质子源。
2. 1. 3 基于石墨烯及氧化石墨烯的SALDI-MS 分析
石墨烯是一种由碳原子以sp2 杂化轨道组成六角形呈蜂巢晶格的平面薄膜，只有一个碳原子厚度的二维材料。2004 年，Novoselov 课题组使用透明胶带发现了石墨烯，并证明其具有良好的电导率。李景虹等首次将石墨烯作为能量转移基质用于小分子量化合物的LDI-MS 分析，包括多种极性分子，如氨基酸、多胺、抗癌药物、核苷，以及胆固醇等的非极性化合物。由于石墨烯具有大面积的纳米片状结构，可以紧紧吸附样品目标物，防止在真空条件下从样品板上脱离，从而避免了污染离子源和真空系统。另外，由于石墨烯具有简单的单层结构及独特的电子性质，能够增强石墨烯基质层上待测物的激光解吸电离效率。该方法样品制备简单，无背景信号，并且具有较好的重现性和耐盐性。同时，利用石墨烯作为吸附剂用于固相提取角鲨烯，可以很大程度上改善其检出限。
蔡宗苇等报道了一种将待测物和石墨烯悬浮液的混合物直接滴加在样品板上，进行负离子模式下的LDI-TOF-MS 直接分析小分子的新方法。实验表明石墨烯可以与待测物混合得到均一的薄膜，从而避免了共结晶现象导致的点与点之间重复性差的问题。
石墨烯是一种双面多环芳烃，其大的离域电子系统还赋予石墨烯的碳环结构具有承载能力高吸附性强的突出优点。鉴于石墨烯的独特性质和其高的化学稳定性，可以将石墨烯作为样品预处理过程中一个好的吸附剂。为了改善其富集效果，可以在富集过程中引用磁性粒子来辅助。Shi 等通过一步水热反应成功合成了磁性Fe3O4负载的石墨烯复合物，将其作为吸附剂应用到样品的预处理中，并通过SALDI-TOF-MS 来分析小分子，并有效消除了传统有机基质所带来的干扰。Kawasaki 等采用包覆由苯胺官能团化的钴纳米粒子(CoC-NH2纳米磁体)的石墨烯富集待测物用于SALDI-MS 分析。CoC-NH2纳米磁体通过静电相互作用及由疏水性的苯基及石墨烯产生的疏水作用，可以实现稀溶液中全氟化合物的有效富集，直接进行SALDIMS分析，实现了对五氯酚、双酚A、含不同链长的氟化物等环境污染物及一些小分子药物的高灵敏度检测。Gulbakan 等通过化学方法得到适配体共轭连接的氧化石墨烯，将其作为亲合萃取剂在不需要任何基质的情况下于血浆样品中选择性富集可卡因和腺苷，直接得到信噪比得到极大改善的质谱图。将不同纳米材料进行合理组合，进而发挥其协同效应，可以实现各类小分子的质谱分析。Kim 等报道了一种氧化石墨烯和胺化的多壁碳纳米管组装的双层激光解吸电离芯片来探测小分子和进行质谱组织成像。
氧化石墨烯与多壁碳纳米管的结合，可以有效地增大其表面粗糙度和吸附待测物的表面积，以此增强激光解吸电离的效率。由于氧化石墨烯/胺化的多壁碳纳米管表面带电荷，使其在水中具有较好的湿润性，这些性质使得氧化石墨烯/胺化的多壁碳纳米管双层结构成为理想的激光解吸电离芯片，实现了对纤维二糖、亮氨酸脑啡肽、葡萄糖、赖氨酸、甘露醇和苯丙氨酸等的高灵敏度(1 nmol)低背景信号的质谱分析。该芯片适合在磷酸缓冲溶液中对小分子物质的直接检测，而无须任何脱盐和富集过程。由于氧化石墨烯、胺化的多壁碳纳米管及基底之间所形成的共价键，具有机械忍耐性，使该芯片具有很好的稳定性，可以重复使用，不存在激光辐射诱导对纳米结构的破坏，可循环检测分析15 次以上。
该课题组进一步报道了金纳米粒子/氧化石墨烯杂化纳米膜用于激光解吸电离质谱分析的新方法。相同实验条件下，单纯氧化石墨烯膜没有任何信号，而杂化膜对于二糖、小肽、单糖和氨基酸的代表物质:纤维二糖、亮氨酸脑啡肽、葡萄糖、赖氨酸及苯丙氨酸的检测限均达到100 pmol。证明在分析小分子时金纳米粒子的负载，可以促进氧化石墨烯膜有效的激光解吸电离。对比实验表明，氧化石墨烯膜上存在金纳米粒子，并且具有适合的密度是成功检测小分子的关键。而氧化石墨烯的存在可以防止快速加热和/或通过其散热降低金纳米的过度加热。该基底可以重复使用10 次。
2. 2 基于硅纳米材料的SALDI-MS 分析
1999 年，Siuzdak 课题组报道了一种用硅晶片在氢氟酸中电化学腐蚀得到的多孔硅(DIOS) 材料用于免有机基质的LDI-MS 分析方法，开启了硅材料在SALDI-MS 方面的研究。由于DIOS 表面能够捕获待测物分子并且有效的吸收紫外激光能量，通过该方法得到的数据信噪比增强并且背景峰最小化。随后该课题组通过甲硅烷基化作用进一步发展了多孔硅芯片，这使得多孔硅表面更加稳定并且具有化学反应惰性。对分子量从150 ～ 12000 Da的分析物，包括药物、肽、碳水化合物和天然产物的大小分子等均通过多孔硅激光解吸电离得到检测，检出限较低。另外，在多孔硅表面修饰其他的功能分子，可进一步扩展其用途。邹汉法课题组报道了一种在多孔硅表面修饰牛血清白蛋白的方法，并以此为芯片成功实现了对蛋白质(BSA)与药物分子相互作用的LDI-MS 分析，进而实现了对蛋白配体的筛选。
2005 年，Siuzdak 课题组还报道了一种硅片上附着硅纳米线阵列进行解吸电离的方法，使用这种材料测试化合物(缓激肽) 检出限为500 fmol，是多孔硅检测限的六分之一。相比传统的MALDI 和多孔硅LDI 方法，10 ～ 40 nm 的硅纳米线阵列只需较低强度的激光，有效降低了背景峰的干扰。之后，该课题组在DIOS 的基础上，又报道了一种解吸离子化效率更好的窗格形硅纳米材料，该材料表面聚集了一种含氟的硅烷或硅氧烷聚合物作为引发剂，受到激光照射时，引发剂会猛烈爆发，释放出离子化的分析物，该方法被称为纳米结构-引发剂质谱( nanostructure-initiator mass spectrometry，NIMS )。与MALDI 中使用的基质不同，NIMS 中选用的引发剂对紫外光没有吸收，不会发生离子化( 避免了化学噪音的引入)，并且也不会与待分析物共结晶(有利于分析物空间分辨率的提高)，因此更适用于生物样品中小分子代谢物的分析及实现组织成像。Siuzdak 课题组利用该材料，报道了一系列工作，实现了对多肽微阵列、单细胞、血液和血清的直接分析和表征，并能实现组织切片中代谢物的质谱成像。
微米尺寸的硅和二氧化硅粒子作为SALDI 基质也同样被研究。结果表明硅可以作为基质，而二氧化硅则不可以。邹汉法等还报道了硅胶及多孔硅粉用于小分子的LDI-MS 分析的应用，研究表明分析物主要是以分子离子峰的形式被检测。众所周知，当材料的尺寸达到纳米级时会表现出一些特殊的性能。Wen 等报道了使用5 ～ 50 nm 的硅纳米粒子对普罗帕酮和维拉帕米药的LDI-MS 分析，研究表明，硅纳米粒子具有很好的分子选择性，耐盐性，可以直接用于检测尿液、其他生物流体、组织中的代谢物及环境中的污染物。Duprec 等则评估了6 种不同形貌和化学修饰的纳米硅表面的激光解吸电离质谱性能。对模拟胰蛋白酶消化的肽液进行质谱分析，结果表明，相比气液固生长技术合成的硅纳米线LDI 表面，金属辅助蚀刻方法合成的纳米硅LDI 表面是最有效的，其中由两个纳米结构层构成的表面提供的LDI-MS 性能最好。并且还发现，有机涂层(烃和碳氟化合物) 的类型显著影响肽的电离效率。
2. 3 基于其他材料纳米粒子的SALDI-MS 分析
纳米粒子(NP) 是指颗粒尺寸在1 ～ 100 nm 范围内的超微粒子，由于其处于微观区域，具有大的比表面积，从而使其具有许多与同质分子不同的物理化学性质，如不同尺寸和形状的纳米粒子表现出显著不同的光学性质及特殊的磁、电、热力学等性能。纳米粒子可以作为SALDI-MS 的基质用于各种生物分子(包括氨基酸类、多肽类、蛋白质类) 的分析及质谱成像，其主要原因在于:(1) 具有较大的表面积，可以为待测物提供着陆点( e. g. ， 1000 smallmolecules per NP);(2) 具有较高的摩尔吸光系数(例如:14 nm 的金纳米粒子在518 nm 处的摩尔消光系数要高于108 mol - 1cm - 1)，可以有效地吸收激光;(3)具有基体干扰最小且呈现优良的富集效应(分析物可以集中在纳米材料的表面，然后通过离心或磁分离很容易与溶液分离);(4)易于高通量制备均匀样品，且其成本较低。
由于纳米粒子的材料各不相同，我们这里只对研究较多的金属纳米粒子( 如Au、Ag、Pt 纳米粒子)，金属氧化物纳米粒子(如ZnO、TiO2纳米粒子)及其他材料的纳米粒子(如EuF3纳米粒子及CdS、ZnS、HgTe 量子点)等在SALDI-MS 方面的应用做一综述。
2. 3. 1 Au 纳米粒子在SALDI-MS 方面的应用
在所有的纳米粒子中，金纳米粒子在SALDI-MS中的应用研究较多。Russell 课题组首次将2、5 和10 nm 三种尺寸的纳米金用于SALDI-MS 多肽分析，其中2 nm 的金纳米粒子表现出最高的电离效率。相比柠檬酸钠包覆的金纳米粒子，巯基苯胺修饰的金纳米粒子的离子化效率增强，离子碎片减少，并增加了待测物的质谱分析范围。Wu 等提出了使用金纳米粒子改善SALDI-MS 分析点到点重现性的样品制备方法。相比于2，5-DHB 基质，该方法即使在高盐溶液中也能实现待测物的定量分析。
金纳米粒子的尺寸、表面是否有包覆分子、在样品靶板上的分布及浓度的优化也是影响金纳米有效进行SALDI-MS 的重要因素。张焕忠课题组应用两种不同尺寸的金纳米粒子( 3. 5 和14 nm) 作为SALDI-MS 分析的探针和基质来分析氨基硫醇。将3. 5 和14 nm 的金纳米粒子进行混合，其中较大的纳米粒子选择性地捕获氨基硫醇而较小的纳米粒子提高SALDI-MS 的灵敏度，对三种氨基硫醇(谷胱甘肽，半胱氨酸和胱氨酸) 的检测限分别可以达到2，20 和44 nM。另外，该方法的实用性也很强，可以实现对MCF-7 细胞裂解液中的谷胱甘肽和细胞质中半胱氨酸的有效分析。Su 等研究了金纳米粒子表面是否有包覆分子及分子的种类对其离子化效率的影响。相比柠檬酸钠或阳离子表面活性剂包覆的金纳米粒子，裸露的金纳米粒子可以将中性碳水化合物，如核糖、葡萄糖、纤维二糖和麦芽糖等捕获到其表面，有效克服了MALDI-MS 对碳水化合物离子化效率低的问题。Amendola 等报道了一种通过在溶液中激光烧蚀合成得到无化学修饰、尺寸具有选择性的金纳米粒子，相比柠檬酸盐稳定的金纳米粒子，其在低分子量区域具有非常低的背景( 500 Da)。对于低分子量分析物，如精氨酸、果糖、莠去津、蒽和紫杉醇检测性能较好，达到pmol。结果表明，金纳米粒子的表面化学和尺寸是影响LDI-MS 灵敏度及选择性的关键参数。
另外，使用金纳米粒子可以实现对各种待测物的SALDI-MS 定量检测。Chen 等报道了一种使用N-2-巯丙酰-甘氨酸修饰的金纳米粒子作为内标物定量测定卡托普利浓度的方法，检测限达1 M。在利用LDI-MS 作为分析手段进行待测物质谱分析的过程中，除了选择常用的紫外激光(337 nm)作为激发光源外，研究者还尝试了其他波长的激光用于该领域的研究。由可见光引起的表面等离子体激发称为局部表面等离子体共振。纳米尺寸的金纳米粒子在可见激光或局部表面等离子体共振附近吸收带的照射下，会造成温度升高及颗粒大小的变化。因此，人们希望通过选择可见光波长范围内的激光，再结合具有局部表面等离子体共振吸收的金纳米粒子进行SALDI-MS 分析，能有效提高待测物的SALDI 效率。Chen 等报道了在Nd:YAG脉冲可见激光(532 nm)激发下，使用金纳米棒实现了生物分子( 多肽和碳水化合物) 的SALDI-MS 分析。
Shibamoto 等在可见激光(532 nm)条件下，结合基于金纳米粒子表面等离子体激发的电荷相互作用，成功实现了待测物的SALDI-MS 超灵敏检测。金纳米棒除了在约520 nm 处有横向的局部表面等离子体共振模式吸收带，在近红外区域也出现局部表面等离子体共振吸收带。进一步，研究者又将LDI-MS 仪器中激光的波长从可见光扩展到近红外激光。
Russell 课题组报道了使用近红外范围的Nd:YAG 激光(1064 nm)，选择金纳米棒为能量转移基质，成功实现了多种生物分子的SALDI-MS分析。为了研究激光的波长对待测物离子化效率的影响，Gmez 等比较了从紫外、可见到近红外范围内，在四种不同波长激光(266，355，532，1064 nm)的激发下，金纳米球、纳米棒和纳米星的SALDI 性能。结果表明，相对于传统的紫外激光，使用可见及近红外的激光，并结合纳米材料的表面等离子体共振，有效地提高了待测物的离子化效率。总体来说，纳米颗粒的等离子体激发和LDI 阈值之间存在密切的相关性。
基于金纳米粒子的SALDI-MS 除了可对表面的吸附物进行有效的质谱分析外，通过合理的设计，还可以作为常规的分析方法用于一些特定组分的检测。最近，Huang 课题组报道了一种基于金纳米粒子修饰的混合纤维素酯膜，通过SALDI-MS 检测水溶液中砷(Ⅲ) 离子的新方法( 亚砷酸盐，AsO2- )。在碱性溶液中，当金纳米粒子与铅离子(Pb2 + )反应时，立即在金纳米粒子表面形成金-铅配合物(氧化铅和氢氧化铅)。随后添加AsO2- ，这些含铅物质迅速与其反应，在金纳米粒子的表面形成PbOAs2O3，(PbO)2As2O3和(PbO)3As2O3。并且在溶液中可以明显观察到金纳米颗粒发生聚集( 过程见图4)。该Pb2 + / Au NPs 探针可以在浓度为0. 6M 的溶液中高选择性检测AsO2- ( 高于其他阴离子和金属离子至少100 倍)。当金纳米粒子修饰的混合纤维素酯膜与AsO2- 反应时，[Pb]+ 的信号强度增强，相反，[Au]+ 的信号强度下降。因此，浓度范围从10 nM ～ 10 M ，随着AsO2- 增加[Pb]+ /[Au]+ 峰值比增加。在信噪比为3 的条件下检测限为2. 5 nM，远低于由美国环境保护署对饮用水中规定的水平(133 nM，约10 ppb)。利用上述方法，该课题组还实现了对蛋白质(凝血酶、血纤维蛋白溶酶)、碘离子及铅离子的检测。通过对实验条件的优化，使该方法具有灵敏度高、选择性好、耐盐性好和高通量的优点。
基于金纳米粒子的SALDI-MS 在对细胞内生物分子的分析方面也发挥了重要作用。Zhu 课题组利用基于金纳米粒子SALDI-MS，首次实现了对细胞内组分的多重分析。在金纳米粒子表面修饰一系列阳离子或中性配体，金纳米粒子以胞吞的形式直接进入细胞，可以特异性结合待分析物，之后对细胞进行溶解、离心分离，最终实现对待分析物的直接质谱分析。另外，通过改变金纳米粒子表面的功能基团可以实现对细胞内不同组分的提取，并进行有效的质谱检测。
2. 3. 2 银纳米粒子在SALDI-MS 方面的应用
另一种在SALDI-MS 领域应用较广泛的金属纳米粒子是银纳米粒子。Chiu 等通过使用在337 nm处具有高的吸收系数(1. 2 108 M- 1cm - 1)的银纳米粒子( ～ 34 nm) 为能量转移基质，实现了对孕妇的尿液样本中三种雌激素，即雌酮( E1)、雌激素(E2)和雌三醇(E3) 的测定。简单的预浓缩后，该方法对E1、E2 和E3 的检测限分别是2. 23，0. 23和2. 11 M。Shrivas 课题组报道了一种基于不同功能基团包覆的银纳米粒子SALDI-MS 分析含硫药物及生物硫醇分子的方法，具有无须进行繁琐的分离、洗涤或淋洗过程等优越性。Wang 课题组则利用金/银核壳纳米粒子实现了对人细胞质样品中多种氨基糖苷类分子的SALDI-MS 分析。其中对巴龙霉素、卡那霉素、新霉素及庆大霉素的检测限分别达到9、130、81 及180 nM。Xiao 等以对巯基苯胺(4-ATP)为还原剂，控制银纳米粒子在硅片表面上的沉积速率，得到表面含有4-ATP 修饰的银纳米粒子涂层的硅材料，以此为SALDI-MS 分析基底，对四吡啶卟啉的检测限达到fmol 级，对催产素、聚乙二醇400 和2300 达到pmol 级。
因为银胶体具有低的反应活性，并且在MALDI板上吹干时不形成晶体，所得到的质谱信号重现性好，这使它们适合在细胞表面定位感兴趣的化合物。例如，Cha 等用胶体银通过质谱成像直接对拟南芥的叶子和花表面的表皮蜡质代谢产物进行成像。实现以银离子加合物的形式对长链脂肪酸、醇、烷烃及酮等化合物的检测。该方法提供了约100 m 的空间分辨率;它已被应用在包括心皮、花瓣、萼片等花的各器官上定位表皮蜡质代谢产物。现已应用烷基酸和烷基胺改性的银纳米粒子在负离子模式下进行质谱成像，以观察小鼠肝脏和视网膜样品中的脂肪酸。另外，通过采用共轭的银纳米粒子质谱成像可以观察到脂肪酸的六种离子图像，而利用DHB 作为基质时则没有检测到任何信号。这种方法对棕榈酸提供的检测限为50 pmol，空间分辨率为10 m。
2. 3. 3 铂纳米粒子在LDI-MS 方面的应用
与银或金材料基底相比，铂材料基底更坚固，铂粒子非常稳定，在大气条件下也不容易氧化。此外，铂纳米粒子是黑色的，因而能够有效的从整个紫外/可见光谱吸收激光。研究表明，铂纳米材料可以用于分析生物小分子，包括肽和磷脂。在这项研究中，在真空条件下利用磁控溅射将铂薄膜涂覆在硅晶片上。铂膜的厚度为10 ～ 40 nm。对血管紧张素的检测限达到低于fmol 水平。在低激光能量和有限样本量的条件下，使用这种新材料可以获得低分子量分子的高分辨质谱。此外，这种新颖的基底在长时间内相当稳定，没有甜点的现象，整个基底表面具有相同的检测灵敏度。更重要的是，电离效率不仅受基底本身性质及其形貌的影响，也受制备过程的影响。
尽管合成方法显著影响材料的形貌及其电离效率，然而在个别情况下，分析结果只由基底材料本身性质决定。例如，由硼氢化钠简单还原H2PtCl6得到的Pt 基底(粉末结构) 和由相同溶液通过电偶位移得到的Pt 基底(自组装的花瓣结构) 的表面形态差异很大，但化合物的LDI 的分析性能几乎是相同的。
Yonezawa 等系统研究了没有包覆稳定剂的金属(Cu，Ag，Au 和Pt) 纳米粒子用于SALDI-MS 分析多肽的可行性。虽然所有金属纳米粒子对SALDI-MS 中的N2激光(337 nm)有能量吸收，但是多肽的代表物血管紧张素Ⅰ解吸/电离性能强烈依赖于金属元素。这些金属纳米粒子之间，Pt 纳米粒子由于其低的热导率和高的熔融温度，在SALDI-MS分析中呈现出最好的性能。此外，Pt 在激光辐照条件下稳定，并且很少形成金属簇离子。相反，银纳米粒子和铜纳米粒子无法实现对血管紧张素Ⅰ的SALDI-MS 检测。另外，Arakawa 课题组制备了一种表面没有任何包覆分子的铂纳米花，可以用于生物分子的SALDI-MS 分析。在相对较低的激光能量下，基于铂纳米花的SALDI-MS 可以实现对肽和蛋白质非常高的检测灵敏度( fmol 级)。Chiang 等研究了六种不同的纳米材料(Au 纳米粒子、TiO2纳米粒子、Se 纳米粒子、CdTe 量子点、Fe3O4纳米粒子和Pt 纳米海绵) 用于SALDI-MS 分析小分子待测物、多肽及蛋白的性能。这些纳米材料中，Pt 纳米海绵和Fe3O4纳米粒子对蛋白质最有效，其检测上限约25 kDa。而对于小分子量的待测物，Au 纳米粒子是最有效的。
使用金属纳米粒子进行SALDI-MS 分析肽类待测物时存在的问题是，即使在过量的质子源三氟乙酸存在下，待测物也是以碱金属离子的加合物形式出现，并且峰值强度低。Yao 等为了提高形成肽的质子加合物的检测效果，研究了铂纳米粒子沉积硅板的不同基底的SALDI-MS 检测效率:(1)电沉积Pt(PGDS)，(2)Pt 颗粒的悬浮沉积，(3) 氧化硅上蒸发铂，(4) 硅蒸发铂。这些基板中，PGDS 板得到的肽的质谱主要是质子加合物。除了铂沉积，当采用钯电沉积作为SALDI-MS 的基板时，其主要形成分子的Na + 和K + 加合物形式。紫外激光辐照介导表面使得PGDS 中(电子和空穴) 电荷有效分离，形成局部正电荷，这对形成肽的质子加合物形式很重要。以PGDS 为基底实现了对甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸、咖啡因、棉子糖和-环糊精的免基质LDI-MS检测。该课题组之后又发展了一系列铂纳米粒子的合成方法，如无电偶置换的条件下在刮痕硅基底上合成三维铂纳米花、在二氧化钛纳米管阵列上光化学沉积铂纳米粒子以及通过全氟癸基三氯硅烷表面改性的方法合成混有铂纳米粒子的硅板，从而实现对-酪蛋白消化物和各种小分子、肽、膦肽、磷脂、碳水化合物及合成聚合物的SALDI-MS 分析。
2. 3. 4 金属氧化物及无机盐纳米粒子在LDI-MS方面的应用
除上述涉及的三种金属纳米粒子外，研究表明，一些金属氧化物及无机盐纳米粒子也可用于SALDI-MS 分析。Watanabe 等使用各向异性的氧化锌纳米粒子进行了SALDI-MS 分析。氧化锌有利于源后衰变分析，能够得到磷脂的简单质谱。另外，还可用于分析合成聚合物:聚乙二醇、聚苯乙烯及聚甲基丙烯酸甲酯，其灵敏性和分子量分布可以达到以DHB 为基质时进行MALDI-MS 分析的水平。Kailasa 等以氧化镁纳米粒子作为一种新的基质对寡糖麦芽七糖、异麦芽酮糖、潘糖、N-乙酰基和-龙胆二糖等寡糖进行SALDI-MS 分析，测得的质谱无背景噪声，在低分子量区域没有碎片离子。相对于SALDI-MS 中常用的其他材料，单晶六角形微盘EuF3纳米颗粒和HgTe 量子点也可以作为非常有效的LDI-MS 分析基质。王志林课题组报道的单晶六角形微盘EuF3在负离子反射模式下分析小肽和氨基酸不存在背景峰。另外EuF3微盘可以成功分析聚乙二醇，检测上限约为35 kDa。张焕忠等发现HgTe 纳米结构是SALDI-MS 分析肽和蛋白的有效基质，具有相对较低的金属离子簇背景信号、较少的碎片离子、碱金属离子加合物干扰少和高的质谱检测范围(150 kDa)等优势。HgTe 纳米结构对于血管紧张素与牛血清白蛋白提供的检测限分别为200 pM 和14 nM，具有较好的重复性(RSD 25%)。利用该方法还实现了对1-抗胰蛋白酶、胰蛋白酶、免疫球蛋白等蛋白与药物分子复合物的检测。
2. 4 基于纳米杂化多孔材料的SALDI-MS 分析
为发挥多种材料的协同作用，将不同组分的纳米材料进行杂化组装，得到的纳米杂化多孔结构被认为是SALDI-MS 发展中非常有前途的一类材料。选择不同组分的纳米材料及不同的杂化组装方法可以实现对杂化多孔结构的表面积、孔径及孔深度的调节，进而对SALDI-MS 的离子化效率进行优化，同时还能对材料表面进行功能化。Okuno 等报道了一系列铂或金包覆的多孔铝亚微米结构，作为基底实现了对生物大分子的SALDI-MS 分析。分析测试中需要的激光强度与材料表面的多孔度有关，包括孔密度及孔径。这种双重基底可以实现对血管紧缩素Ⅰ 和维拉帕米的fmol 级检测。Jokinen 等则设计了三种不同包覆的多孔钛基底，包覆材料分别是无定形硅、铝及氮化硅，进而将三种杂化多孔材料用于SALDI-MS 分析。研究证明，相对于高热导率的纳米材料而言，具有低热导率的质谱基底对分析物有更好的离子化效率。Nitta等报道了一种以金纳米粒子修饰的二氧化钛纳米管阵列作为表面增强拉曼光谱和SALDI-MS 双功能平台。该纳米结构保持了二氧化钛纳米管阵列的多孔结构，并融合了金纳米粒子的高电离效率，两种分析方法进行结合，能够用于区分吡啶类化合物的异构体，并实现了对两种杀菌剂聚氨基甲酸酯和二硫代氨基甲酸酯的高灵敏度检测。
石墨烯是已公认的LDI 效率较高的纳米材料，选择石墨烯并结合多孔材料得到的纳米杂化多孔材料被认为对提高LDI 的离子化效率非常有利。尽管二氧化硅纳米粒子单独使用时不能作为LDI-MS 分析的能量转移体，而选择具有介孔结构的二氧化硅纳米粒子时，则能为待分析物提供更多的附着位点。
Abdelhamid 等制备了一种石墨烯包覆介孔二氧化硅纳米粒子的杂化材料，作为一种新颖的功能材料，可以实现对多糖( 如麦芽庚糖、龙胆二糖、异麦芽酮糖、潘糖等)及阳离子型表面活性剂(如氯化十六烷基三甲基铵、四甲基氢氧化铵、四丁基氢氧化铵、氯化十六烷吡啶、氯化-1-丁基-3-甲基咪唑、十二烷基硫酸钠) 的SALDI-MS 分析。由于该纳米材料表面的负电荷与阳离子表面活性剂之间的静电作用，可以富集稀溶液中的分析物，进而实现对表面活性剂的高灵敏度检测。
层层组装是制备纳米材料的常用方法，可以将一种或多种纳米材料在一定基底上进行合理组装，得到具有新性质的纳米组装体。Kawasaki 等利用层层组装法在硅片上设计了一种金纳米粒子的组装多孔膜，可以实现对多肽及环境污染物的SALDI-MS分析。研究表明，层层组装多孔膜中纳米粒子层数对血管紧缩素Ⅰ的离子化效率有非常重要的影响，另外，分析物的峰强度随着层数的增加而增加。而且多孔结构还可以实现对溶液中环境污染物( 芘及二甲基双十八烷基氯化铵) 的富集，进而实现对分析物的高灵敏度检测。将具有较好离子化效率的纳米材料进行组装，实现其SALDI-MS 活性的最优化，Kuo 等利用旋涂层层组装法构建了基于石墨烯和金纳米粒子的层状结构，将待测物的溶液滴在该纳米杂化结构上，可以直接用于SALDI-MS 分析，该法成功检测了包括氨基酸，碳水化合物及多肽等系列小分子量化合物，并通过石墨烯和金纳米粒子层数变化对质谱信号进行优化，显著提高了分析结构的信号强度，信噪比及重现性。
SALDI-MS 还可以对纳米杂化多孔材料表面的自组装单分子层进行分析。洪敏等报道了将导热性差的二氧化硅纳米粒子与导热性好的金纳米粒子进行杂化层层组装，利用SALDI-MS 实现对纳米杂化多孔材料表面的11-五甘醇-1-十一烷硫化物单分子层的免有机基质的LDI-MS 分析。同时该多孔杂化材料还可以实现对表面组装的寡聚核苷酸单分子层的MALDI-MS 分析，能够促使金-硫键的断裂，对比研究证明杂化材料的组分及多孔结构对该分析方法起关键作用。
大量的研究表明，对于特定的纳米材料而言，其能量转移过程两种机理都有可能发生。而影响其离子化效率的因素也较多，如材料的组分、尺寸、形状或结构以及纳米粒子在分析体系中的浓度等。一般来说，选择导电或导热性好的材料，增大基底的比表面积，而对组装材料增加其多孔性等都有利于提高SALDI-MS 的离子化效率。但并不是材料的能量转移能力越高越好，如吴坤明等做了一系列碳材料的对比实验，结果表明，能量转移能力越高其离子解吸效率反而越低，即解吸离子化效率:碳纳米管～ 富勒烯 纳米多孔石墨 石墨颗粒 热解石墨 纳米金刚石;而能量转移能力则有如下顺序:碳纳米管富勒烯～ 纳米多孔石墨 石墨颗粒～ 热解石墨 纳米金刚石。因此，关于SALDI-MS 具体的分析机理还需进一步研究。
3 结论及展望
由于具有样品制备简单、信噪比高、重现性好及高耐盐性的优势，SALDI-MS 已成为分析生物样品的一个重要分析工具。纳米材料偶合质谱技术进一步促进了其相应的功能，使SALDI-MS 检测的质量范围已从低分子量区域扩展到高分子量区域，可以检测蛋白质和合成聚合物等大分子，以及药物、肽、碳水化合物和非极性化合物等生物小分子，实现各种待测物的定量检测，而且能实际应用于高通量的药物筛选。
对于复杂生物样品的分析，样品制备对获得高质量的质谱中起着至关重要的作用。在LDI-MS 分析中，包括SALDI 和MALDI，来自生物样品中多种组分的信号抑制是一个明显的缺点。因此，样品分离及从样品混合物中富集目标待测物是激光解吸电离质谱分析检测目标待测物的一个非常重要的步骤。纳米材料在样品预处理中有着巨大的潜力，尤其是微量待测物的富集，因为纳米材料表面通过羧酸、胺、硫醇、环氧树脂、羟基和蛋白质官能化，使纳米材料的表面可以从复杂混合物中吸附待测物。此外，吸附待测物的纳米材料可以直接进入质谱仪分析无需任何处理。这些对于简化SALDI-MS 分析的预处理及提高检测的灵敏度都非常有利。
另外，SALDI 也存在着一些缺点:(1) 产生的质子化分子离子效率低;(2)相比MALDI 过程，SALDI过程是较硬的电离过程，会使不稳定化合物产生一定的碎片;(3) 部分纳米材料在进行强激光的质谱分析时会产生离子簇( 比如金簇离子Aun+ 或Aun- ，以及碳簇离子Cn-)或纳米材料自身存在的干扰峰( 如富勒烯分析中涉及的C60- 离子峰)，这就要求在相应的分析过程中选取合适的方法对此类干扰信号进行抑制; ( 4 ) 相对来说，SALDI-MS 不容易分析分子量很大的分子( 如DNA);(5) SALDI 的表面很容易被污染，会造成一定的背景信号。为了解决这些问题，预计对SALDI的新纳米材料制备的持续改进，及对SALDI 过程中物理化学性质的了解，将会进一步扩大SALDI-MS的应用范围及检测灵敏度。比如，最近聂宗修等利用研究较热的纳米碳点为基质用于低分子量化合物的SALDI-MS 分析，包括氨基酸、肽、脂肪酸以及-兴奋剂和中性寡糖，其中硬脂酸得到最低检测限为0. 2 fmol。平行实验证明，与其他碳材料相比，由于其良好的分散性，该研究体系的检出限比羟基富勒烯低超过2 个数量级，比氧化石墨烯、碳纳米管和石墨低1 ～ 2 个数量级。但分析过程中，在m/z 120 的区间会产生一系列C1- 到C10- 的离子簇干扰峰，这是亟待解决的问题。
随着现代纳米技术的发展，SALDI-MS 必将发挥越来越重要的作用，其应用涉及不同研究领域，从最初在生物学和药理学方面的应用，到环境化学、有机化学、表面化学及高分子化学的分析，对工业产品如合成聚合物和添加剂的分析检测以及现在研究较多的生物成像等。